分光光度法測定地表水中葉綠素a的進一步研究

王一會，王志瑞，吳德景，郭 瑩

(安順生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，貴州 安順 561000)

葉綠素a本身對環(huán)境沒有危害，但它是估算浮游植物生物量的重要指標(biāo)[1]。在環(huán)境監(jiān)測中，葉綠素a含量是評價水體富營養(yǎng)化的指標(biāo)之一，是國家地表水環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測網(wǎng)采測分離分析中必測項目之一。通過測定水中浮游植物葉綠素a的含量，可以掌握水體的初級生產(chǎn)力情況和富營養(yǎng)化水平[1]。

目前已經(jīng)報道的葉綠素a測定方法有高效液相色譜法、熒光光度法和分光光度法，但由于高效液相色譜儀價格昂貴、分析操作繁雜，熒光光度法易受其它色素或者色素衍生物的干擾等均不便原因，使得前兩者于進行大規(guī)模的野外測試，故而最常使用的多為分光光度法[2]。

已有的報道中，對葉綠素a的提取，部分研究采用了不進行研磨的處理方法，如超聲破碎法[3]和液氮凍融法[4-5]等。但國家所有的權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)方法均需要進行研磨處理。研磨操作存在條件不容易控制、葉綠素a易流失導(dǎo)致分析測試結(jié)果偏低；溶劑易揮發(fā)使得操作者身體受到傷害的同時也污染環(huán)境；且研磨耗時的缺點使得該法在測試大量樣品時存在分析耗時周期長、樣品中葉綠素a流失等諸多弊端。本研究擬在已有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6-7]和報道[8]的基礎(chǔ)上，結(jié)合實驗室已有條件，初步探究分光光度法測定地表水中葉綠素a的更優(yōu)條件。

1 材料和儀器設(shè)備

水樣樣品，安順市水源點；丙酮，成都諾爾施科技有限責(zé)任公司；碳酸鎂，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；乙酸纖維濾膜(直徑50 mm，孔徑0.45 μm)，上海興亞凈化材料廠；GM-1.0A隔膜真空泵，天津沸騰實驗設(shè)備有限公司；玻璃砂芯過濾裝置，天津沸騰實驗設(shè)備有限公司；T9紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LD-5型電動力離心機，貴州榮華儀器制造有限公司；Ar 1140電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；實驗室常用儀器設(shè)備。

2 實驗部分

(1) 采用分光光度法測定水質(zhì)中的葉綠素a，參考HJ 897-2017 《水質(zhì) 葉綠素a的測定 分光光度法》。以安順市水源點的地表水為分析樣品、提取試劑為90 %丙酮、濾膜為0.45 μm乙酸纖維濾膜、樣品保存方法為每升水中加入1 mL碳酸鎂懸濁液于0～4 ℃避光保存，24 h內(nèi)分析，濾膜直接放入帶塞刻度離心管中，用吸管加入90 %丙酮，定容至10 mL，放置于-20～0 ℃避光浸提，浸提過程中劇烈搖晃1～2次，浸提時間為4～12 h，然后以3500 r/min離心10 min，用針式過濾器過濾，以90 %丙酮為參比，用3 cm比色皿于波長750、664、647、630處測量吸光度并計算葉綠素a含量，實驗結(jié)果見表1和 表2。

表1 空白樣品多次測定結(jié)果Table 1 The results of blank samples were tested for several times

表2 研磨與不研磨的測定結(jié)果比較Table 2 Comparison of measurement results between grinding and non-grinding

(2) 將同一樣品用(1)所描述方法進行葉綠素a的提取，后分別用1 cm和3 cm光程比色皿進行測定，比較測定結(jié)果，該對比實驗以兩個樣品為供試對象，實驗結(jié)果見表3。

表3 不同光程比色皿測定結(jié)果Table 3 The results of different water samples were determined by different cuvettes

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 實驗結(jié)果

3.1.1 與現(xiàn)有環(huán)保部標(biāo)準(zhǔn)方法的檢出限作對比研究

對空白樣品進行7次平行測定，計算測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。

由表1 中數(shù)據(jù)計算出：檢出限MDL=t(n-1，0.99)× S = 0.00011 × 3.143 mg/L = 0.0004 mg/L，該值低于環(huán)保部規(guī)定的0.002 mg/L，滿足國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3.1.2 研磨與不研磨的比較

測定同一水樣經(jīng)直徑為50 mm，孔徑為0.45 μm的乙酸纖維濾膜過濾后，分別采用玻璃研缽手工研磨和不研磨的方式對其中的葉綠素a進行提取，測定結(jié)果如下：

t檢驗結(jié)果表明采用研磨和不研磨兩種方法對測定結(jié)果有顯著差異，說明研磨過程中葉綠素a有損失。本次實驗中葉綠素a測定時的損失量為4%～25%。

3.1.3 不同光程下吸光度的比較

由表3可以看出：將比色皿光程由1 cm換成3 cm后，樣品8和9在A750、A664、A647和A630處的吸光度均大幅度提高，初步表明改用3 cm比色皿可以提高分光光度法測定地表水中葉綠素a的吸光度，進而提高該方法的靈敏度。

3.2 討 論

(1) 實驗結(jié)果表明：本研究通過結(jié)合低溫凍融和超聲破碎法，使用改進后的方法，對葉綠素a進行提取，該方法減少了提取過程中葉綠素a的損失，更加準(zhǔn)確的反映了樣品中葉綠素a的含量。同時該操作提高了工作效率、降低了分析人員的工作強度，也減少了試劑和玻璃器皿的消耗。

(2) 國家標(biāo)準(zhǔn)[6-7]中提到：該法使用的比色皿的長度為 1 cm，根據(jù)多年對貴州省內(nèi)葉綠素a的測定發(fā)現(xiàn)，A664波長處的吸光度最大，但是吸光度均小于0.100；再結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)[7]中指出：分光光度法選擇比色皿的光程長度應(yīng)視所測溶液的吸光度而定，以使其吸光度落在0.1～0.7之間為宜。所以本研究通過改用3 cm的比色皿進行測定，提高了吸光度，進一步降低了測定誤差和檢出限。

4 結(jié) 論

本研究通過改進樣品中葉綠素a的提取步驟和改變比色皿的量程。可有效提高水中葉綠素a的測定效率，減少了試劑和玻璃器皿的消耗，減少了葉綠素a測定過程中的損失，更加真實的反映了環(huán)境中葉綠素a的含量，保障了人民群眾的環(huán)境知情權(quán)；同時也降低了方法檢出限，為更精確測定葉綠素a提供了方法依據(jù)，也可為葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)測定方法的建立提供一定參考價值。