陸川豬CSRP3基因克隆及其組織表達差異分析

陳云 潘鵬丞 陳釗 姜長津 關志惠 陳寶劍 梁晶 謝炳坤 覃兆鮮

摘要：【目的】克隆陸川豬的富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3（CSRP3）基因，并對其進行生物信息學和組織表達譜分析，為研究CSRP3基因在陸川豬肌肉生長過程中的作用機制打下基礎。【方法】根據NCBI已公布的野豬CSRP3基因序列設計特異性定量引物和克隆引物，運用RT-PCR克隆CSRP3基因并進行生物信息學在線分析，采用實時熒光定量PCR檢測CSRP3基因在陸川豬各組織中的表達差異。【結果】陸川豬CSRP3基因編碼區（CDS）全長854 bp，編碼194個氨基酸殘基，與NCBI已公布的野豬CSRP3基因CDS序列相比存在5處同義堿基突變，且陸川豬與野豬氨基酸序列相似性達100.0%;陸川豬CSRP3基因的編碼蛋白分子量為20935.82 Da，分子式為C964H1404N262O274S19，理論等電點（pI）為8.89，不穩定系數為39.11，表明其是偏堿性的穩定蛋白;CSRP3蛋白二級結構主要由無規則卷曲構成，三級結構可能有一種模型;陸川豬CSRP3蛋白除有多個磷酸化位點之外，無跨膜結構和信號肽;陸川豬CSRP3基因在心臟中表達量最高，背最長肌次之，在肝臟中的表達量最低。【結論】CSRP3基因在陸川豬心臟中表達量最高，背最長肌次之且明顯高于其他組織，說明該基因可能對肌肉生長有一定影響。

關鍵詞： 陸川豬;CSRP3基因;基因克隆;生物信息學分析

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-0977-08

Cloning and differential expression analysis of CSRP3 gene

in Luchuan pig

CHEN Yun1， PAN Peng-cheng2， CHEN Zhao2， JIANG Chang-jin1， GUAN Zhi-hui2，

CHEN Bao-jian2， LIANG Jing1， XIE Bing-kun2， QIN Zhao-xian2*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning， Guangxi? 530004， China; 2 The Animal Husbandry Research Institute of Guangxi/Guangxi Key Laboratory of Livestock Genetic Improvement，

Nanning， Guangxi? 530001， China）

Abstract：【Objective】The cysteine and glycine rich protein 3（CSRP3）of Luchuan pig was cloned and the bioinformatics and tissue expression profile were analyzed， so as to lay foundation for studying the role of CSRP3 gene in muscle growth of Luchuan pigs. 【Method】According to the sequence of wild boar CSRP3 gene published on NCBI，specific quantitative primers and cloning primers were designed，CSRP3 gene was cloned by RT-PCR，and bioformatics analysis was conducted online. Finally，the expression difference of CSRP3 gene in various tissues of Luchuan pig was detected by qPT-PCR. 【Result】The CDS region of Luchuan pig CSRP3 gene was 854 bp in length， encoding 194 amino acids. Compared with the wild boar CSRP3 gene CDS region published on NCBI，there were 5 synonymous base mutations. The amino acid sequence was the same and its similarity was 100.0% between Luchuan pig and wild boar. Molecular weight of the protein encoded by the CSRP3 gene of Luchuan pig was 20935.82 Da， and its molecular formula was C964H1404N262O274S19， the theoretical isoelectric point was 8.89 and the instability coefficient was 39.11，which indicated that it was a stable protein with alkalinity. The secondary structure of CSRP3 gene was mainly composed of random coils and there might be a model of tertiary structure. Luchuan pig CSRP3 protein had no transmembrane structure and signal peptide except for multiple phosphorylation sites. Luchuan pig CSRP3 gene had the highest expression in the heart，followed by muscle tissue. The expression in the liver was the lowest. 【Conclusion】The expression of CSRP3 gene is highest in the heart of Luchuan pigs，followed by muscle. And the expression in heart and muscle are significantly higher than that in other tissues，indicating that this gene may have a certain effect on muscle growth.

Key words： Luchuan pig; CSRP3 gene; gene cloning; bioinformatics analysis

Foundation items： Guangxi Science and Technology Plan Project（Guike AB21196060）; Central Government Guided Local Scientific and Technological Development Special Funds（Guike ZY20198019，Guike ZY21195052）

0 引言

【研究意義】陸川豬是我國地方優良豬種，具有抗逆性強、耐粗飼、繁殖能力強及肉質好等特點，其原產地位于廣西陸川縣（關意寅，2020）。陸川豬為我國優質的脂肪型豬種，肌間脂肪含量高，肉香味美，而深受廣大消費者喜愛。但與市場主流商品豬種相比，其胴體瘦肉率較低，市場競爭力不足，具有較大的遺傳改良空間。富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3（Cysteine and giy-cine rich protein 3，CSRP3）是富含半胱氨酸的蛋白家族成員，是進化上的保守蛋白，主要參與肌細胞增殖和分化的過程（Louis et al.，1997）;其通過與LC3蛋白的相互作用促進形成自噬體，從而參與調節肌肉萎縮（Cui et al.，2020）。因此，克隆陸川豬CSRP3基因并進行組織表達差異分析，可對陸川豬的育種改良提供重要參考。【前人研究進展】目前，已有許多國內學者對陸川豬肉質性狀相關基因進行研究。謝婉等（2018）研究表明，GPR1基因對陸川豬脂肪沉積有一定影響;鄧章超等（2019）成功克隆了DGAT2基因編碼區（CDS）序列，認為DGAT2 基因可能會影響陸川豬脂肪沉積;焦迪等（2019）研究認為，IGFBP5基因可能是影響陸川豬瘦肉率的原因之一，為進一步研究陸川豬的瘦肉率和胴體性狀提供了新的遺傳標記;潘鵬丞等（2020）對PDK4基因進行研究，結果表明其在皮下脂肪中表達量顯著高于在其他組織中的表達量，為研究陸川豬脂肪沉積機制提供了參考。關于CSRP3基因的研究方面，Xu等（2010）研究表明，在豬胚胎骨骼肌發育過程中CSRP3基因mRNA表達量上調，表明其在肌肉生長發育過程中具有重要作用，可作為影響豬肉品質的候選基因;He等（2014）研究表明，CSRP3基因的一些組合基因型與秦川牛的生長和胴體性狀顯著或極顯著相關，說明CSRP3基因作為標記基因在提高牛生長性能和胴體性狀方面具有較高潛力;Sun等（2014）研究發現，富含肌肉的miRNAs靶向CSRP3基因來參與骨骼和肌肉系統的發育過程;Han等（2019）研究表明，雞敲除CSRP3基因后，衛星細胞分化受到抑制，表明CSRP3可能在促進雞衛星細胞分化過程中起重要作用，影響雞骨骼肌生長發育（Li et al.，2020），可作為影響雞骨骼肌生長發育的候選基因（單艷菊等，2020）。此外，有學者通過敲除斑馬魚和小鼠的CSRP3基因，發現CSRP3基因有調節骨骼肌葡萄糖穩態和維持骨骼肌機械穩定性的作用（Hernandez-Carretero et al.，2018;Chang et al.，2019）。【本研究切入點】CSRP3參與細胞分化和肌肉生長等過程，并與家畜的生長性狀和胴體性狀密切相關，但目前國內鮮有學者對陸川豬CSRP3基因進行研究和報道。【擬解決的關鍵問題】克隆陸川豬CSRP3基因，使用在線軟件對CSRP3蛋白進行分析，并對比陸川豬不同組織中CSRP3基因的表達差異，為進一步研究CSRP3基因在陸川豬生長發育過程中的作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

試驗材料為3頭8月齡陸川豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌和脂肪組織樣本，由廣西畜牧研究所提供。主要試劑：TRIzol試劑、反轉錄試劑盒、定量試劑盒、pMD18-T、Premix Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;酵母浸出物和胰蛋白胨購自Oxoid公司;膠回收試劑盒購自杭州博日科技有限公司;瓊脂糖購自Biowest公司;DL2000 DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司;大腸桿菌Trans 5α感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設計與合成 參考NCBI的野豬CSRP3基因序列（NM_001172368.1），使用Oligo 7.0設計陸川豬CSRP3基因的定量引物（CSRP3-Fa和CSRP3-Ra）及克隆引物（CSRP3-Fb和CSRP3-Rb）（表1），以18S RNA作為內參基因，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成所有引物。

1. 2. 2 RNA提取和cDNA合成 采用TRIzol法分別提取陸川豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌和脂肪的RNA，以紫外分光光度計檢測所提RNA的純度和濃度，按照試劑盒說明反轉錄合成cDNA。

1. 2. 3 PCR擴增 以CSRP3-Fb和CSRP3-Rb為引物、陸川豬背最長肌cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系10.0 μL：cDNA模板1.0 μL，CSRP3-Fb/CSRP3-Rb各0.3 μL，無酶無菌水3.4 μL，Premix Taq DNA聚合酶5.0 μL。擴增程序：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 55 s，進行35個循環，4 ℃終止擴增。

1. 2. 4 膠回收連接及測序 PCR產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證，并回收目的條帶，回收產物運用快速連接法與pMD18-T載體連接。連接體系10 μL：pMD18-T載體1 μL，Insert DNA 4 μL，Solution I 5 μL。16 ℃反應30 min，將連接產物轉化至Trans 5α感受態細胞，37 ℃培養1 h，吸取60 μL轉化產物均勻涂布在含有氨芐抗性的平板上，37 ℃培養10 h，挑單克隆陽性菌接種于3 mL含有氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中培養至菌液渾濁，然后用菌液進行PCR驗證，將陽性PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 2. 5 實時熒光定量PCR 以cDNA為模板，18S RNA為內參基因進行實時熒光定量PCR。反應體系20.0 μL：cDNA模板4.0 μL，CSRP3-Fa/CSRP3-Ra各0.6 μL，無酶無菌水4.8 μL，SYBR Green MasterMix 10.0 μL。擴增程序：95 ℃ 15 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 32 s，進行40個循環。每個樣本3次技術重復，采用2-ΔΔCt法計算CSRP3基因在陸川豬各個組織中的相對表達量。

1. 3 生物信息學分析

使用軟件MegALign檢測對比陸川豬與其他物種CSRP3基因編碼的氨基酸序列的相似性，并依據相似性構建系統發育進化樹。運用ProtParam分析預測CSRP3蛋白理化性質、SOPMA預測分析CSRP3蛋白高級結構、SWISS-MODEL和ProtScale預測分析CSRP3蛋白親/疏水性和跨膜結構、MHMM Server 2.0預測分析CSRP3蛋白信號肽、SignalP 4.1N預測分析CSRP3蛋白糖基化位點、NetNGlyc1.0和NetPhos 3.1 Server預測分析CSRP3蛋白磷酸化位點和激酶位點、WoLF PSORT預測分析CSRP3蛋白的亞細胞定位、CD-search預測分析CSRP3蛋白保守結構域。

2 結果與分析

2. 1 基因克隆結果

獲得PCR擴增產物后，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行驗證，結果在750 bp附近觀察到與預期結果相符的明亮單一條帶（圖1）。

2. 2 生物信息學分析結果

2. 2. 1 測序結果分析 通過克隆獲得CSRP3基因CDS序列（854 bp），共編碼194個氨基酸殘基，與野豬CSRP3基因CDS序列（NM_001172368.1）進行對比，發現共有5處同義堿基突變（圖2）。利用MegAlign 軟件對所得CDS序列與NCBI已公布的野豬（NM_001172368.1）、牛（NM_001024689.3）、人類（NM_003476.5）、小鼠（NM_001198841.1）、大鼠（NM_057144.2）和原雞（NM_001199486.1）的CSRP3基因的DS序列進行同源比對（圖3），其相似性分別為100.0%、98.5%、98.5%、97.4%、97.4%和88.7%。同時，構建的CSRP3基因系統發育進化樹（圖4）顯示，陸川豬與野豬的親緣關系最近，與原雞的親緣關系最遠。

2. 2. 2 蛋白理化性質 經ProtParam分析預測顯示，CSRP3蛋白分子量為20935.82 Da，分子式為C904H1404N262O274S19，理論等電點（pI）為8.89，偏堿性，N端氨基酸殘基為酪氨酸，在194個編碼蛋白中，甘氨酸（Gly）含量最多，為13.4%，CSRP3蛋白在體外的半衰期為30 h，不穩定系數為39.11，屬于穩定蛋白。

2. 2. 3 蛋白三級結構 使用SOPMA預測分析CSRP3蛋白二級結構，結果顯示陸川豬CSRP3蛋白二級結構中無規則卷曲占比最高（47.42%），延伸鏈、α-螺旋和β-轉角占比分別為22.68%、17.53%和12.37%（圖5）;進一步預測分析蛋白三級結構，發現陸川豬CSRP3蛋白三級結構可能有1種模型（圖6）。

2. 2. 4 蛋白親/疏水性 ProtScale預測分析顯示，陸川豬CSRP3蛋白疏水分值最大為1.222，疏水分值最小為-2.044，分別位于第147位氨基酸和第97位氨基酸。結合圖7結果分析，陸川豬CSRP3蛋白具有親水性。

2. 2. 5 蛋白跨膜結構和信號肽 通過SignalP 4.1對陸川豬CSRP3蛋白信號肽和跨膜結構進行預測，結果顯示CSRP3蛋白無信號肽存在（圖8），也不存在跨膜結構（圖9）。

2. 2. 6 蛋白磷酸化位點和糖基化位點 經NetPhos 3.1 Server對CSRP3蛋白磷酸化位點進行預測分析，結果顯示陸川豬CSRP3蛋白可能存在20個磷酸化位點（圖10），且該蛋白上存在25個蛋白激酶結合位點（PKC、UNSP、GSK13、CKⅡ、P38MAPK、CDC2、INSR和PKG等）。經NetNGlyc 1.0預測分析，結果顯示陸川豬CSRP3蛋白在106和158氨基酸序列處各有1個糖基化位點（圖11）。

2. 2. 7 亞細胞定位和蛋白保守結構域 經WoLF PSORT對陸川豬CSRP3蛋白進行亞細胞定位分析顯示，CSRP3蛋白在細胞核、線粒體和細胞質占比分別為69.6%、17.4%和13.0%。使用CD-search預測分析陸川豬CSRP3蛋白保守結構域，結果顯示陸川豬CSRP3蛋白存在2個LIM結構域（圖12）。

2. 3 CSRP3基因組織表達差異分析

以陸川豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、背最長肌和脂肪cDNA為模板，18S RNA為內參基因，運用實時熒光定量PCR技術檢測CSRP3基因在陸川豬不同組織中的表達情況，結果（圖13）顯示，CSRP3基因在陸川豬心臟中的表達量最高，背最長肌次之，在其他組織中的表達量明顯低于心臟和背最長肌，在肝臟中表達量最低。

3 討論

富含半胱氨酸蛋白基因家族包括CSRP1、CSRP2、CSRP3和TLP基因。其中，CSRP3基因通過編碼CSRP3蛋白，主要在橫紋肌中發揮作用（Liu et al.，2016），參與肌細胞調控和結構蛋白調控（Flick and Konieczny，2000）。Xu等（2010）檢測通城豬和長白豬胚胎3個不同發育階段骨骼肌CSRP3基因mRNA的表達水平，結果顯示CSRP3基因表達量總體呈上升趨勢。Han等（2019）研究發現，敲除雞CSRP3基因后，TGF-β信號通路中的Smad3磷酸化升高，抑制了雞衛星細胞分化。Li等（2020）通過GO富集分析和KEGG通路分析篩選256個雞發育階段與肌肉發育、細胞數量和能量代謝相關的常見調控基因，其中CSRP3基因在3～18周表達量顯著上調。由此可見，CSRP3在肌細胞分化和肌肉生長發育過程中發揮重要作用，但目前關于陸川豬CSRP3基因的研究鮮有報道。

本研究成功克隆獲得陸川豬CSRP3基因CDS序列，其全長為854 bp，編碼194個氨基酸殘基，與NCBI上公布的野豬CSRP3基因CDS序列存在5處同義突變。該結果與單艷菊等（2020）的研究結果相似，同義突變雖不改變編碼的氨基酸，但可影響基因的轉錄速度，從而影響蛋白功能，這可能造成陸川豬與野豬CSRP3基因功能的差異，而陸川豬CSRP3基因5處同義突變會對機體產生何種影響尚需深入研究。通過與NCBI上已公布的各物種CSRP3基因CDS序列進行同源比對分析，發現陸川豬與野豬的CSRP3基因氨基酸序列相似性高達100.0%，與哺乳動物（牛、人類、小鼠和大鼠）氨基酸序列相似性均在97.4%以上，表明CSRP3基因在不同物種間具有高度保守性;而與非哺乳動物（原雞）的氨基酸序列相似性只有88.7%，與白佳靈等（2020）的研究一定相似性。本研究中，經預測分析發現，陸川豬CSRP3基因的編碼蛋白分子量為20935.82 Da，理論等電點為8.89，不穩定系數為39.11，表明其為偏堿性的穩定蛋白;CSRP3蛋白無跨膜結構，也無信號肽，表明不具備分泌功能，二級結構主要由無規則卷曲構成，三級結構可能有一種模型。此外，陸川豬CSRP3蛋白有多個磷酸化位點。蛋白磷酸化有可能改變蛋白結構，激活蛋白活力，從而影響豬肉品質（Li et al.，2019;Zou et al.，2020），CSRP3蛋白的多個磷酸化位點可能對陸川豬肉質產生一定影響。本研究發現，CSRP3蛋白在細胞核、線粒體和細胞質占比分別為69.6%、17.4%和13.0%，與白佳靈等（2020）的研究存在差異，可能是因物種不同導致產生差異。在細胞核中，CSRP3蛋白通過促進bHLH因子與調控元件的結合，調控肌肉生長發育相關基因（Kong et al.，1997），在細胞質中，CSRP3作為支架蛋白，與許多結構蛋白相互作用，從而維持肌細胞的肌動蛋白基礎的細胞結構（Arber and Caroni，1996）;因此，CSRP3蛋白可能有維持陸川豬肌細胞穩定及調控肌肉生長發育的作用。

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，CSRP3基因在所檢測的陸川豬各組織中均有表達，且CSRP3基因除在心臟中高表達之外，在肌肉中的表達量也顯著高于在其他組織中的表達量，與Arber等（1994）對CSRP3基因編碼肌肉LIM 蛋白（MLP）在骨骼肌和心肌中特異性表達的研究結果一致，說明CSRP3基因主要在陸川豬心肌和骨骼肌中發揮作用（Liu et al.，2016）。綜上所述，CSRP3基因參與肌細胞調控和肌肉生長發育過程，在肌肉發育和肌細胞的結構維護中起核心作用（Rashid et al.，2015），研究結果為進一步探究CSRP3基因對陸川豬肌肉生長的作用機理提供了重要參考。

4 結論

CSRP3基因在陸川豬心臟中表達量最高，背最長肌次之且明顯高于其他組織，說明該基因可能對肌肉生長有一定影響。

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收稿日期：2021-09-08

基金項目：廣西科技計劃項目（桂科AB21196060）;中央引導地方科技發展專項（桂科ZY20198019，桂科ZY21195052）

通訊作者：覃兆鮮（1983-），https：//orcid.org/0000-0003-3247-8108，副研究員，主要從事地方豬繁殖育種研究工作，E-mail：zhx_qin@163.com

第一作者：陳云（1996-），https：//orcid.org/0000-0001-6797-9098，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：1259314173@qq.com