不同檢測方法在結核性腦膜炎診斷中的應用價值分析

張麗，周忠，陳默，陳秋悅，萬雅璐，王倩

（貴州省貴陽市公共衛生救治中心 呼吸與危重癥學科，貴州 貴陽 550002）

0 引言

結核性腦膜炎是結核分枝桿菌感染所引發的脊膜、腦膜的非化膿性炎癥性疾病，是肺外結核的一種，多數患者均有急性、亞急性、慢性血行播散型肺結核，其殘疾率與死亡率均較高[1-2]。結核性腦膜炎，其起病隱匿，具有進展速度慢特點，部分患者的疾病起病急驟，在疾病的早期，疾病癥狀較為輕微，但是患者顱內壓水平的升高，可出現顱內壓增高、腦膜刺激征等的表現[3]，如視乳頭水腫、嘔吐、頭痛等，病情嚴重者會出現去皮質狀態、腦強直發作等的情況[4]，對患者的生命安全，造成威脅，因此，積極做好患者疾病的診斷以及治療干預，對其預后改善意義重大。本研究主要對不同的檢測技術，在診斷結核性腦膜炎中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取結核性腦膜炎患者，為其實施細菌學檢測技術（腦脊液抗酸桿菌涂片、腦脊液分枝桿菌慢速培養）、分子生物學檢測方法[腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸的檢測（即PCR檢測法），腦脊液結核分枝桿菌的檢測，利福平耐藥基因檢測（Gene Xpert檢測）]、免疫學檢測方法[PPD試驗（結核菌素試驗）、外周血T-SPOT·TB（外周血T細胞斑點試驗）]、腦脊液常規、生化實驗室檢測結果等檢測，例數276例，時間為2020年1月-2021年12月，對其檢測的結果進行分析。納入標準：確診存在結核性腦膜炎；局部神經損害癥狀者。排除標準：其他感染所致中樞神經系統疾病者；伴有腰穿禁忌證者；近期（3個月）抗結核治療者。276例患者中，年齡16～66歲，平均（40.36±11.27）歲；病程1～39d，平均（16.98±7.22）d。

1.2 方法

1.2.1 PPD檢測

左前臂掌側1/3處，將0.1mL卡介菌純白蛋白衍生物稀釋劑注入，48～72h后，檢查注射部位，測量浸潤硬結的相關垂直徑，并測量橫徑，若均值≥5mm，即代表為陽性，若在<5mm，則為陰性。

1.2.2 T-SPOT·TB檢測

肝素抗凝管，外周靜脈血采集，5～10mL，密度梯度離心法作外周血單個核細胞的分離，已包被抗體微量板四孔中，將濾液培養蛋白10、早期分泌性靶抗原6、陽性對照植物血凝素、陰性對照細菌培養液等加入，每孔中，將外周血單個核細胞加入后，于37℃的培養中，進行培育，培訓時間為16～20h。采用磷酸鹽緩沖液，實施5次的洗滌免疫，200倍稀釋濃度標記抗體試劑，在每個反應孔中，均加入辣根過氧化物酶標記的相關鏈霉菌卵白素，在37℃的溫度下，進行1h孵育，磷酸鹽緩沖液5次洗滌，每個反應孔中加入50ulACE底物顯色溶液，室溫中孵育7min。去離子水洗滌培養板，終止反應。室溫干燥培養板每個反應孔中，深藍色清晰斑點的數目，進行記錄。陰性對照孔斑點數≤5個，檢測孔A、B斑點數≥6個，為陽性；陰性對照孔斑點數≥6個，檢測孔A、B斑點數≥陰性對照孔2倍斑點數，為陽性；反之為陰性。

1.2.3 培養慢速培養腦脊液分枝桿菌

腰穿后取1～2mL腦脊液實施結核菌的培養，以全自動分枝桿菌培養鑒定/藥敏儀實施結核菌的培養，并實施藥敏試驗，按照操作說明，對腦脊液培養，8周后若無菌生長，則表示為陰性。

1.2.4 腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸檢測

多采用檢測試劑盒，即樣品DNA提取試劑，PCR反應試劑、特異性擴增引物，所述特異性擴增引物有16SrRNA擴增引物MTC與Rv0355擴增引物CD192組成，分析結核與肺結核分枝桿菌種屬特異性基因，優化引物選擇設計，并優化檢測條件，提供更準確、更加靈敏、更加快捷的結果?？赏ㄟ^擴增產物是否生成來判斷目標基因是否存在。

1.2.5 Gene Xpert檢測（腦脊液結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測）

以IS6110和gyrB為靶基因，針對靶基因的六個特定區域設計F3，B3，FIP，BIP四條特異性引物。終產物為具有不同莖長度莖環結構的DNA和帶有許多環折疊結構的DNA混合物，可通過擴增產物是否生成來判斷目標基因是否存在。

1.3 觀察指標

對結核性腦膜炎患者經PPD檢測、腦脊液結核分枝桿菌培養、外周血T-SPOT·TB檢測、腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸檢測、腦脊液結核分枝桿菌檢測及利福平耐藥基因檢測等多種方法疾病檢出情況分析。

1.4 數據分析

SPSS 22.0軟件實施數據處理，方差同質性檢驗方法，定性數據以“χ2”核實，采用（%）表達。P<0.05，顯著差異。

2 結果

多種方法聯合檢測，相較于單一方法檢測，其對結核性腦膜炎的檢出率，更高（P<0.05），如表1。

表1 不同方法對結核性腦膜炎疾病檢出情況分析[n(%)]

3 討論

結核性腦膜炎是結核分枝桿菌，侵入至其蛛網膜下腔，所致蛛網膜、軟腦膜累及腦血管部分、腦實質病變的疾病，是神經系統的結核疾病。結核性腦膜炎發生后，有著較高的殘疾率以及死亡率，因此，及時為結核性腦膜炎患者實施診斷，并采取治療干預，對患者病情的改善有重大意義。結核性腦膜炎的癥狀與其他中樞神經系統感染較相似，誤診率較高，臨床常選擇腦脊液結核桿菌培養、腦脊液涂片鏡檢等方法，實施疾病的診斷，雖然有著一定的價值，但是陽性檢出率較低，且易發生假陽性[5-7]，因此，應選擇更加合理的方法，進行疾病的檢測。

本研究中，多種方法聯合檢測，相較于單一方法檢測，其對結核性腦膜炎的檢出率更高，P<0.05。即代表多種方法聯合檢測，于結核性腦膜炎診斷中，有著較高的價值。PPD在結核性腦膜炎診斷中應用，雖然可獲得一定的效果，但是其單獨應用，較易出現假陽性的情況。結核病原學是對結核性腦膜炎診斷的金標準，但是較易受到標本中細菌數量的相關影響，且培養結核分枝桿菌的周期較長，其檢測的陽性率較低，對于疾病早期快速診斷，存在一定的局限性。隨著PCR技術水平的不斷進步，使得腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸檢測的應用價值得以提高，靈敏度較高，研究顯示，檢測腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸，診斷結核性腦膜炎，其敏感度的差異性可能與實驗室PCR所用的引物、靶基因、反應條件不同等有關，但是其特異度較高，相較于結核病原學，其有著較高的靈敏度以及特異度，因此，腦脊液結核/非結核分枝桿菌核酸檢測在結核性腦膜炎診斷中有著一定的價值[8-9]。利福平耐藥基因檢測是美國公司研發的半巢式的一種實時熒光定量PCR體外診斷方法，其是以利福平耐藥基因rpoB基因作為靶向基因，在2h內同時進行結核分枝桿菌以及對利福平是否耐藥的檢測，此種方法被WHO推薦用于診斷肺外結核中。利福平耐藥基因檢測在結核性腦膜炎診斷中應用，有著較高的時效性，且能夠對患者的病情、預后以及生存情況進行一定的判斷，對患者疾病的診治有著一定的指導意義[10-11]。ESAT-6/CFP-10融合蛋白，是結核分枝桿菌復合群基因RD-1區域，結核特異性蛋白抗原，經在少數致病性的分枝桿菌的基因組中存在，也可在結核分枝桿菌復合群中存在，可刺激細胞，使其產生INF-γ，在結核性疾病診斷中，受到卡介苗等因素的影響較小，因此兩種抗原多肽結合制備，可提高檢測的特異性，且能夠提高檢測的敏感性[12-13]，此種方法多數應用于2周以上原因不明發熱者結核病篩查中，或者存在HIV感染、免疫力低下等肺外結核病等患者的相關診斷中疾病診斷中，卡介苗接種人群對于結核病的篩查，此技術操作簡單，且具有快捷的優點，能夠避免患者出現免疫功能損傷，所致假陽性的情況。根據以上原理，外周血T-SPOT·TB檢測可對結核抗原特異性T淋巴細胞檢測，可采取酶聯免疫吸附法及酶聯免疫斑點法，在特異性抗原刺激下，生成特異性INF-γ[14]。外周血T-SPOT·TB檢測具有簡單快捷的特點，可防止免疫功能受損所致假陽性的情況，更好提高疾病的檢出率[15]。雖然外周血T-SPOT·TB檢測有著一定的應用價值，但是單一方法進行疾病的診斷，易出現誤診與漏診的情況，臨床常將多種檢測方法相結合，以此促進疾病檢出率的提高。

綜上所述，不同方法在結核性腦膜炎患者疾病診斷中應用，均有著一定的價值，多種方法聯合檢測，可更好為患者疾病的診治提供參考依據，意義重大。