LncRNA SNHG14通過調控miR-372-3p對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響

王丹 成剛 廖英

缺血性腦卒中是由于腦部供血不足、供血動脈狹窄或閉塞引起的腦部組織壞死，具有較高的致殘率、發病率和死亡率，嚴重威脅人類的生命健康安全[1,2]。星形膠質細胞廣泛分布在大腦中，通過神經遞質轉運等方式對神經損傷具有保護作用，腦部缺血引起的星形膠質細胞損傷能加劇神經細胞的死亡[3]。所以，如何有效減緩星形膠質細胞損傷是預防缺血性腦卒中的重要研究方向。隨著研究的不斷深入，長鏈非編碼RNA(lncRNA)在缺血性腦卒中包括神經系統內疾病是近年醫學研究的熱點，如MALAT1、MEG3、H19、CaMK2D等已被證實[4]。有研究結果顯示，SNHG14在OGD/R誘導的神經細胞內表達上調，抑制SNHG14能降低OGD/R誘導的神經細胞的炎性反應[5]，但是OGD/R誘導的星形膠質細胞研究相對較少。miRNA與神經系統疾病密切相關[6]，有研究發現，miR-372-3p在OGD誘導星形膠質細胞內表達下調，miR-372-3p靶向負調控TLR4減緩OGD誘導星形膠質細胞凋亡和氧化損傷，并促進細胞的增殖[7]。在線生物信息學網站預測顯示SNHG14和miR-372-3p存在互補的核苷酸序列，本研究通過OGD/R損傷細胞模型，探討SNHG14通過調控miR-372-3p對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 剛出生24 h的5只SD級大鼠購自上海斯萊克實驗動物有公司，許可證號SCXY(滬)2017-0005。大鼠飼養在本實驗內，室溫20～24℃，相對濕度50%～60%，自由進食和飲水，待適應7 d后進行實驗。DMEM/F12無糖培養基、胎牛血清、DMEM/F12高糖培養基購自美國Gibco公司；si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-372-3p、anti-miR-NC、anti-miR-372-3p和引物購自賽默飛世爾公司；Lipofectamine 2000試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；PrimeScript RT試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本Takara公司；MTT試劑盒購自上海晶抗生物；凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物；Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購自美國CST公司；HRP標記的二抗購自武漢博士德生物；TNF-α試劑盒、IL-10試劑盒購自南京建成生物研究所；雙熒光素酶試劑盒購自Promega公司。

1.2 細胞分離和培養 將SD大鼠斷頭處死后，在無菌條件下分離大鼠腦皮質，剪碎后在2.5 g/L胰蛋白酶內室溫消化30 min，并加入DMEM/F12完全培養基終止消化，輕輕吹打過200目篩，1 000 r/min離心5 min，調整細胞密度為1×106個/ml接種至培養瓶內，37℃、5%CO2條件培養箱培養，每2～3天更換1次培養液，細胞融合生長至80%時傳代培養。

1.3 建立模型和分組 取1.2培養的大鼠星形膠質細胞，沖洗3次，更換為不含血清的DMEM/F12無糖培養基，然后在三氣培養箱(1% O2、5% CO2和94% N2)內培養6 h，然后更換為DMEM/F12完全培養基，在37℃、5% CO2培養24 h，模擬建立OGD/R細胞模型。將細胞分為Control組、OGD/R組、OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-SNHG14組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-372-3p組、OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組和OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組。其中Control組為進行任何處理的星形膠質細胞，OGD/R組為進行OGD/R處理；將按照脂質體法將si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-372-3p、si-SNHG14和anti-miR-NC、si-SNHG14和anti-miR-372-3p轉染至星形膠質細胞內，然后進行OGD/R處理，記為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-SNHG14組、OGD/R+miR-NC組、OGD/R+miR-372-3p組、OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組和OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組。細胞轉染時按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行，細胞培養48 h進行后續實驗。

1.4 qRT-PCR檢測SNHG14和miR-372-3p的表達量 取1.3各組星形膠質細胞使用TRIzol試劑提取細胞內總RNA，并檢測純度和濃度，使用Prime Script RT試劑盒與2 μg的RNA反轉錄合成cDNA，然后將1 μl的cDNA與SYBR-Green染料在PCR儀上進行擴增反應。分別以GAPDH和U6作為內參，采用2-ΔΔCt法計算SNHG14和miR-372-3p的表達量。SNHG14正向引物序列：5’-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3’，反向引物序列：5’-CTTCCAAAAGCCTTCTGCCTTAG-3’；miR-372-3p正向引物序列：5’-CGGAAAGTGCTGCGACATTT-3’，反向引物序列：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 MTT檢測細胞活力 取1.3各組星形膠質細胞固定培養48 h后，每孔內加入20 μl的MTT試劑，然后在37℃、5% CO2培養箱內繼續培養4 h，然后繼續加入150 μl的二甲基亞砜試劑，充分混勻后，置于酶標儀490 nm處檢測吸光度值，計算細胞活力。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 取1.3各組星形膠質細胞采用PBS清洗細胞，加入500 μl的Binding buffer懸浮細胞，根據凋亡試劑盒說明，加入5 μl的Annexin V-FITC以及PI試劑，避光反應15 min后在流式細胞儀上觀察細胞凋亡情況。

1.7 Western blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達 取1.3各組星形膠質細胞加入RIPA裂解液，混勻后在冰上裂解10 min，按照BCA法檢測定量蛋白濃度，取50 μg蛋白樣品經過SDS-PAGE凝膠電泳處理，轉膜，封閉培養，加入Bcl-2(稀釋比例1∶500)、Bax(稀釋比例1∶500)和GAPDH(稀釋比例1∶1 500)抗體，4℃過夜孵育，計入HRP標記的二抗(稀釋比例1∶5 000)，室溫下孵育2 h，然后在PVDF膜上滴加化學發光液顯色、曝光，采用Image Pro軟件進行分析。

1.8 ELISA檢測TNF-α、IL-10表達 取1.3各組星形膠質細胞上清液，嚴格按照TNF-α試劑盒、IL-10試劑盒說明書，檢測TNF-α、IL-10的表達。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 構建SNHG14的野生型和突變型熒光素酶載體(SNHG14-WT和SNHG14-MUT)，然后與miR-NC或miR-372-3p共轉染至星形膠質細胞內，轉染48 h后按照雙熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 SNHG14和miR-372-3p在OGD/R誘導的星形膠質細胞的表達 與Control組比較，OGD/R組內SNHG14表達量明顯增加(P<0.05)，miR-372-3p表達量明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 SNHG14和miR-372-3p在OGD/R誘導的星形膠質細胞的表達

2.2 敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響 與Control組比較，OGD/R組內SNHG14表達量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)，細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與OGD/R+si-NC組比較，OGD/R+si-SNHG14組的內SNHG14表達量、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、TNF-α、IL-10明顯降低(P<0.05)，細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達

表2 敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響

2.3 過表達miR-372-3p對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響 與Control組比較，OGD/R組內miR-372-3p、細胞活力、Bcl-2表達明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)；與OGD/R+miR-NC組比較，OGD/R+miR-372-3p組內miR-372-3p、細胞活力、Bcl-2明顯增加(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax、TNF-α、IL-10明顯降低(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 過表達miR-372-3p對OGD/R誘導的星形膠質細胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達

表3 過表達miR-372-3p對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響

2.4 SNHG14靶向miR-372-3p的表達 通過在線生物信息學網站預測顯示SNHG14和miR-372-3p存在互補的核苷酸序列。為了進一步驗證SNHG14和miR-372-3p的關系，采用雙熒光素酶報告實驗進行驗證二者的關系，結果顯示，與miR-NC組比較，miR-372-3p組內SNHG14-WT熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，SNHG14-MUT熒光素酶活性沒有任何變化。見圖3，表4。

圖3 SNHG14和miR-372-3p存在互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.5 抑制miR-372-3p可以逆轉敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響 與OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-NC組比較，OGD/R+si-SNHG14+anti-miR-372-3p組內miR-372-3p表達量、細胞活力、Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白表達、TNF-α、IL-10明顯增加(P<0.05)。見圖4，表5。

圖4 抑制miR-372-3p可以逆轉敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞凋亡的影響；A 凋亡圖；B Bcl-2、Bax蛋白表達

表5 抑制miR-372-3p可以逆轉敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響

3 討論

SNHG14是由19.2 kb轉錄本組成的，位于15q11.2號染色體上，多數研究結果表明SNHG14通過參與細胞活力、凋亡、炎性反應等對多種細胞的損傷具有保護作用[8,9]。有研究發現，在腦部缺血再灌注損傷研究中，SNHG14在OGD/R誘導的小鼠海馬細胞內高表達，SNHG14通過調控miR-182-5p/BINP3軸促進神經元的損傷[10]。Zhang等[11]的研究結果顯示，SNHG14在腦缺血再灌注模型內高表達，抑制SNHG14能夠減輕OGD誘導的小膠質細胞炎性反應和氧化應激。Qi等[12]研究結果顯示，SNHG14在OGD誘導的小膠質細胞內高表達，miR-145-5p是SNHG14靶基因，SNHG14通過靶向負調控miR-145-5p減緩OGD誘導的小膠質細胞炎性損傷。本研究結果顯示，OGD/R處理星形膠質細胞能夠抑制細胞活力，促進細胞凋亡率，TNF-α、IL-10顯著增加，Bax蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調，SNHG14表達量顯著增加，這說明SNHG14可能與星形膠質細胞損傷有關。本研究通過敲低SNHG14發現，敲低SNHG14能促進OGD/R誘導的星形膠質細胞的活力，抑制細胞凋亡率，TNF-α、IL-10顯著降低，Bax蛋白表達下調，Bcl-2蛋白表達上調，這說明敲低SNHG14能保護OGD/R誘導的星形膠質細胞損傷。

miRNA在腦缺血再灌注損傷內異常表達[13]，如miR-216a在腦缺血再灌注損傷小鼠模型內低表達，miR-216a通過調控JAK2減緩OGD/R誘導神經細胞的凋亡和炎性反應，并促進細胞的活力[14]。林斯革等[15]在研究腦缺血再灌注損傷中發現，miR-153通過調控Keap1/Nrf2/HO-1通路減緩小膠質細胞的炎性反應和氧化應激。閆海清等[16]研究結果顯示，miR-497-5p在OGD/R誘導的神經細胞內高表達，miR-497-5p通過靶向負調控FOXO3減緩OGD/R誘導的神經細胞凋亡、氧化應激和炎性反應，以上均說明miRNA與腦缺血再灌注損傷密切相關。本研究結果顯示，通過OGD/R處理星形膠質細胞后miR-372-3p表達量顯著降低，實驗結果發現，過表達miR-372-3p能夠促進OGD/R誘導的星形膠質細胞的活力，抑制細胞凋亡率、TNF-α、IL-10顯著降低，下調Bax蛋白表達，上調Bcl-2蛋白表達，說明過表達miR-372-3p減輕OGD/R誘導的星形膠質細胞損傷。SNHG14能夠調控下游多個miRNA并發著作用，例如SNHG14通過調控miR-124-3p/MMP2軸減輕缺氧/復氧誘導的腎小管上皮細胞炎性反應和氧化應激[17]。本研究采用starbase預測、并通過雙熒光素酶實驗證實miR-372-3p是SNHG14的靶基因，深入一步研究發現，抑制miR-372-3p可以逆轉敲低SNHG14對OGD/R誘導的星形膠質細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響，這說明SNHG14通過靶向miR-372-3p的表達參與OGD/R誘導的星形膠質細胞損傷。

綜上所述，敲低SNHG14能促進OGD/R誘導星形膠質細胞的增殖，減輕細胞的凋亡和炎性損傷，其作用機制可能與過表達miR-372-3p有關。