lncRNA LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導心肌細胞凋亡的機制研究

江帆 劉寧 翟鑫 管頻 董霄

糖尿病性心肌病是由糖尿病患者引起的一種并發癥，且能夠引發心力衰竭、心律失常和休克，嚴重時可導致猝死，也是糖尿病患者死亡率較高的原因之一[1,2]。糖尿病性心肌病的發病機制受多種因素的制約和影響，心肌細胞凋亡、氧化應激是誘導糖尿病性心肌病的主要因素[3,4]。因此，尋找糖尿病性心肌病的治療和診斷具有重要作用。長鏈非編碼RNA是一類超過200個核苷酸的非編碼RNA，不能夠參與編碼蛋白的合成，與心血管性疾病的發展密切相關[5]。Liu等[6]研究結果顯示，LINC00528在心肌梗死模型細胞中表達上調，LINC00528通過調控miR-143-3p/COX-2軸抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，但是對高糖誘導心肌細胞的研究機制尚不明確。核因子E2相關因子2(Nrf2)/血紅素加氧酶1(HO-1)信號通路是細胞氧化應激的經典通路[7]，有研究發現，柚皮素能夠通過激活AMPK/Nrf2/HO-1信號通路減緩糖尿病小鼠的心肌細胞的凋亡、炎性反應和氧化損傷[8]。本研究通過高糖誘導心肌細胞建立細胞損傷模型，探討LINC00528是否能夠通過調控Nrf2/HO-1信號通路影響高糖誘導心肌細胞凋亡和氧化應激。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 H9C2心肌細胞購買于南京凱基生物；胎牛血清、高糖DMEM培養基購買于美國Gibco公司；葡萄糖購買于美國Sigma公司；si-NC、si-LINC00528、pcDNA、Nrf2和引物購買于上海吉瑪公司；Lipofectamine 2000試劑盒購買于美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購買于北京于天根生化公司；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購買于上海碧云天生物；Bcl-2抗體、Bax抗體、Nrf2抗體、HO-1抗體、NQO1抗體和GAPDH抗體購買于美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的二抗購買于北京中杉金橋公司；MDA試劑盒和SOD試劑盒購買于南京建成生物。

1.2 細胞培養與分組 取出冷凍的H9C2心肌細胞快速解凍后，在含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養基內孵育，置于37℃、5% CO2密閉恒溫培養箱中培養。H9C2心肌細胞生長至對數生長期時，進行消化傳代培養。收集2～3代較為穩定的H9C2心肌細接種至96孔板內(1×105個/ml)，將細胞分組，分比為：Con組：細胞正常培養，加入5.5 mmol/L葡萄糖處理細胞；HG組：加入30 mmol/L葡萄糖處理細胞，HG+si-NC組：轉染si-NC后進行高糖處理細胞；HG+si-LINC00528組：轉染si-LINC00528后進行高糖處理細胞；HG+si-LINC0052+pcDNA組：共轉染si-LINC0052和pcDNA后進行高糖處理細胞；HG+si-LINC00528+Nrf2組：共轉染si-LINC00528和Nrf2后進行高糖處理細胞。細胞進行轉染時按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行操作。

1.3 qRT-PCR檢測LINC00528的表達 收集Con組、HG組、HG+si-NC組、HG+si-LINC00528組的H9C2心肌細，按照Trizol法提取各組細胞的總RNA后，在紫外分光度計進行檢測定量RNA濃度和純度。將RNA按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA模板，在熒光定量PCR試劑盒說明書下進行PCR擴增。LINC00528正向引物為：5’-AGCGTCCTTGAGGAGTCCAGTTC-3’，反向引物為：5’-CAAGCACAGTCACGTTCTGAGGTC-3’；GAPDH正向引物為：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAA-3’，反向引物為：5’-AATGAAGGGGTCATTGATGG-3’。以GAPDH作為內參，通過2-ΔΔCt法計算LINC00528的表達。

1.4 MTT檢測細胞活力 收集H9C2心肌細胞，取100 μl細胞懸液鋪在96孔板內，密度為1×103個/孔，在密閉恒溫培養箱內培養48 h，在每孔加入20 μl的MTT試劑，然后繼續培養4 h，并加入150 μl的DMSO試劑，帶結晶充分溶解后，在酶標儀490 nm處檢測細胞吸光度，計算細胞活力。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組H9C2心肌細胞，48 h加入預冷的緩沖液清洗2次，加入binding buffer用于制備細胞懸液，取100 μl的細胞懸液、及5 μl Annexin V-FITC和PI試劑混勻，然后在暗處室溫下反應15 min，置于流式細胞儀上檢測細胞的凋亡率。

1.6 Western blot檢測Bcl-2、Bax和Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白的表達 收集各組H9C2心肌細胞，加入RIPA裂解液后提取各組細胞的總蛋白，檢測定量各組總蛋白濃度和純度。在每孔上樣至SDS-PAGE凝膠孔內處理分離，迅速轉移在PVDF膜上，并封閉培養2 h，加入Bcl-2、Bax、Nrf2、HO-1、NQO1和GAPDH稀釋的抗體，4℃過夜孵育，加入稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育2 h，加入化學發光試劑，在暗處進行曝光，在凝膠成像系統下掃描蛋白條帶，以GAPDH為內參，計算分析目的蛋白的表達。

1.7 ELISA檢測MDA含量和SOD活性 收集各組H9C2心肌細胞，1 000 r/min離心10 min后收集細上清液，取200 μl按照MDA試劑盒和SOD試劑盒說明書步驟，檢測各組細胞中MDA含量和SOD活性。

2 結果

2.1 LINC00528在高糖誘導心肌細胞中的表達 qRT-PCR結果顯示，與Con組比較，HG組中LINC00528表達顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00528在高糖誘導的心肌細胞的表達

2.2 抑制LINC00528對高糖誘導的心肌細胞活力和凋亡的影響 與Con組比較，HG組LINC00528表達、細胞凋亡率和Bax蛋白表達升高(P<0.05)，細胞活力、Bcl-2蛋白表達降低(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組LINC00528表達、細胞凋亡率和Bax蛋白表達降低(P<0.05)，細胞活力、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1，表2。

圖1 抑制LINC00528對高糖誘導的心肌細胞活力和凋亡的影響；A 細胞凋亡率；B 凋亡相關蛋白

表2 抑制LINC00528對高糖誘導的心肌細胞活力和凋亡的影響

2.3 抑制LINC00528對高糖誘導的心肌細胞氧化應激的影響 與Con組比較，HG組的MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)；HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 抑制LINC00528對高糖誘導的心肌細胞氧化應激的影響

2.4 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達 與Con組比較，HG組的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與HG+si-NC組比較，HG+si-LINC00528組的Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖2，表4。

表4 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達

圖2 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路蛋白的表達

2.5 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導的心肌細胞活力、凋亡和氧化應激的影響 與HG+si-LINC0052+pcDNA組比較，HG+si-LINC00528+Nrf2組的Nrf2蛋白表達、細胞活力、Bcl-2蛋白表達和SOD活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，細胞凋亡率、Bax蛋白表達和MDA含量顯著降低(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導心肌細胞活力、凋亡和氧化應激的影響

圖3 LINC00528通過調控Nrf2/HO-1信號通路對高糖誘導心肌細胞凋亡的影響；A 細胞凋亡率；B 凋亡相關蛋白

3 討論

糖尿病性心肌病是糖尿病并發癥之一，近年糖尿病患者發病率呈上升趨勢，其中關于心血管并發癥最為嚴重[9]。長期在高糖環境下能夠引起心肌細胞的凋亡、纖維化，導致心肌細胞損傷引起心肌細胞紊亂、心力衰竭等[10]。因此，本研究結果顯示，高糖能夠抑制細胞活力、SOD活性，促進細胞凋亡率、MDA含量，下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，表明高糖誘導心肌細胞損傷模型成功。lncRNA在糖尿病性心肌病內異常表達，與高糖誘導心肌細胞凋亡和氧化應激密切相關，參與糖尿病性心肌病的發展[11,12]。Yang等[13]研究顯示，KCNQ1OT1在高糖誘導的心肌細胞和糖尿病小鼠心臟組織中表達上調，沉默KCNQ1OT1能夠減緩高糖誘導心肌細胞凋亡。Wu等[14]研究顯示，MALAT1在高糖誘導的心肌細胞中表達上調，MALAT1通過靶向miR-141-3p促進高糖誘導的心肌細胞凋亡。陳婉斐等[15]研究顯示，LUCAT1在高糖誘導的心肌細胞中表達上調，利用siRNA技術，發現抑制LUCAT1通過調控miR-204-3p能夠減緩高糖誘導的心肌細胞凋亡、氧化應激。HAGLROS在高糖誘導的心肌細胞表達上調，抑制HAGLROS通過上調miR-20a-5p并激活PI3K/AKT信號通路減緩高糖誘導的心肌細胞的凋亡[16]。本研究結果顯示，高糖誘導心肌細胞后LINC00528表達上調，抑制LINC00528可以降低LINC00528表達、細胞凋亡率、MDA含量，促進細胞活力、SOD活性，上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，說明抑制LINC00528能夠減緩高糖誘導的心肌細胞損傷。

Nrf2/HO-1信號通路是較為重要的內源性氧化應激通路，與細胞的抗氧化、抗炎和細胞凋亡等密切相關[17]。Nrf2是抗氧化反應的重要轉錄因子，可以與keap1形成復合物，當體內發生氧化應激時，能夠與抗氧化反應原件相結合，進而啟動下游HO-1、NQO1等抗氧化基因的表達，發揮其在機體內的氧化應激反應[18,19]。侯劍飛等[20,21]研究顯示，紅芪多糖通過激活ERK/Nrf2/HO-1信號通路減緩大鼠心肌細胞的氧化應激損傷。賈強等[22]研究顯示，金雀異黃酮通過調節Nrf2/HO-1信號通路減緩糖尿病大鼠的心肌細胞氧化損傷。本研究結果顯示，高糖誘導心肌細胞后Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達下調，抑制LINC00528可以上調Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達；說明LINC00528能夠調控Nrf2/HO-1信號通路的表達。在心肌細胞轉染過表達Nrf2，結果顯示，細胞活力、SOD活性受到促進，并抑制細胞凋亡率、MDA含量，上調Bcl-2蛋白表達，下調Bax蛋白表達，說明LINC00528通過激活Nrf2/HO-1信號通路減緩高糖誘導心肌細胞的損傷。

綜上所述，LINC00528在高糖誘導心肌細胞中表達上調，抑制LINC00528能夠減緩高糖誘導心肌細胞凋亡和氧化損傷，其作用機制可能與Nrf2/HO-1信號通路有關。