CCR6、p38在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義

王素珍 張潔民

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是頭頸部常見的惡性腫瘤，其早期癥狀不明顯，病灶隱匿，患者就診時多處于中晚期，治療效果不理想[1,2]。因此，積極探究NPC發病機制，尋找可早期診斷、評估NPC預后的指標甚是關鍵。目前，研究認為，NPC發病與信號通路改變、炎性反應、環境因素、抑癌基因失活、EB病毒感染、癌基因激活等相關[3,4]。CC趨化因子受體6(CC-chemokine receptor 6,CCR6)是一種G蛋白偶聯受體，其在肝細胞癌中表達上調，其可能通過影響癌細胞增殖、侵襲及血管生成，進而影響肝細胞癌發生發展[5]；p38是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族的一員，其在NPC中表達水平升高，與腫瘤TNM分期顯著相關，可作為評估NPC臨床分期的潛在指標[6]；且CCR6可通過激活P38途徑促進喉癌細胞轉移及增殖[7]。而CCR6在NPC中的表達水平與p38的關系及二者與NPC預后的關系鮮有報道。本研究通過測定NPC患者癌組織CCR6、p38表達水平，旨在分析二者關系及其與NPC預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月至2017年9月我院收治的NPC患者91例進行研究，均符合按《鼻咽癌診斷和治療》有關NPC判定標準[8]進行診斷。男54例，女37例；年齡37～70歲，平均年齡(54.75±11.28)歲；<55歲者43例，≥55歲者48例；淋巴結轉移者49例，淋巴結未轉移者42例；TNM分期中Ⅰ～Ⅱ期者62例，Ⅲ～Ⅳ期者29例；低分化者35例，中、高分化者56例；有吸煙史33例，無吸煙史58例。受試對象及家屬簽署知情同意書，本研究符合《赫爾辛基宣言》，經醫院倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：①患者符合NPC診斷標準，經術后組織病理檢查/鼻內鏡下活檢明確診斷；②患者入院前未接受放化療或其他抗腫瘤治療；③患者具備完整檢查資料。

1.2.2 排除標準：①合并嚴重感染性疾病、肝、腎、心等器官功能障礙者；②合并其他惡性腫瘤、失訪者。

1.3 方法

1.3.1 組織標本收集:NPC患者進行根治性切除術時，留取部分NPC組織以及對應癌旁正常組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后，置于甲醛溶液中固定，制備石蠟標本切片，備用。

1.3.2 免疫組化法檢測NPC組織、癌旁正常組織標本CCR6、p38蛋白表達情況：取石蠟組織切片(約3 μm 厚)，應用免疫組化SP法染色，操作步驟依據試劑盒說明書，一抗為兔抗人CCR6抗體(貨號：ab78429，Abcam公司)、p38抗體(貨號：gtx48614，Genetex公司)，二氨基聯苯胺顯色30 s，蘇木素復染2～3 s，自來水洗10～15 min，蒸餾水洗，不同濃度乙醇脫水，封片，顯微鏡(型號：Ti2，日本尼康)下拍照。依據陽性細胞比例(A)與染色程度(B)評分乘積判斷CCR6、p38蛋白表達情況，A：將陽性細胞比例<25%、25%～49%、50%～75%、>75%分別定義為0、1、2、3分；B：將染色程度無色、淡黃色、棕黃色、黃褐色分別定義為0、1、2、3分。CCR6、p38蛋白表達評估結果(A×B)：<3分為陰性，以≥3分為陽性。

1.4 隨訪 患者出院后進行3年隨訪，以門診、微信、電話為主要隨訪方式，隨訪截至2020年9或NPC患者死亡，統計NPC患者生存情況。

2 結果

2.1 NPC患者組織中CCR6、p38蛋白表達情況 免疫組化結果顯示，CCR6主要定位于細胞質/細胞膜，p38主要定位于細胞核。與癌旁正常組織比較，NPC組織CCR6、p38蛋白陽性表達率顯著升高(P<0.05)。見圖1、2，表1。

陰性表達 陽性表達

陰性表達 陽性表達

表1 NPC患者組織中CCR6、p38蛋白表達情況 n=91,例(%)

2.2 NPC組織CCR6、p38表達水平與臨床病理特征關系 NPC組織CCR6、p38表達水平均與腫瘤淋巴結轉移、TNM分期、分化程度明顯相關(P<0.05)，與性別、吸煙史、年齡無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 NPC組織CCR6、p38表達水平與臨床病理特征關系 例

2.3 NPC組織中CCR6表達水平與p38的相關性 Spearman等級相關性分析顯示，NPC組織中CCR6表達水平與p38呈正相關(r=0.583，P<0.001)。見表3。

表3 NPC組織中CCR6表達水平與p38的相關性 例

2.4 NPC組織CCR6、p38表達水平與NPC患者預后的關系 對91例NPC患者進行36個月跟蹤隨訪，死亡31例，總生存率為65.93%。CCR6陽性組NPC患者術后36個月總生存率為54.39%，明顯低于CCR6陰性組生存率85.29%(χ2=9.058，P=0.003)；p38陽性組NPC患者術后36個月總生存率為54.55%，明顯低于p38陰性組總生存率83.33%(χ2=8.028，P=0.005)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，CCR6陽性組NPC患者術后36個月累積生存率明顯低于CCR6陰性組(χ2=8.002，P=0.005)；p38陽性組NPC患者術后36個月累積生存率明顯低于p38陰性組(χ2=7.613，P=0.006)。見圖3、4。

圖3 癌組織CCR6表達水平與NPC患者預后的關系

2.5 NPC患者預后的影響因素 COX單因素分析顯示，淋巴結轉移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預后的危險因素(P<0.05)，分化程度是影響NPC患者預后的保護因素(P<0.05)；多因素分析結果顯示，淋巴結轉移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預后的獨立危險因素(P<0.05)。見表4。

圖4 癌組織p38表達水平與NPC患者預后的關系

表4 影響NPC患者預后因素的COX回歸分析

3 討論

NPC是一種源于鼻咽部黏膜的腫瘤，其發病率較高，隨著放化療的完善，NPC患者治療效果雖有所提高，但不甚理想，對患者生存質量構成威脅[9,10]。因此，積極尋找與NPC發生發展，且可評估NPC預后的標志物，對及早診斷NPC、制定個體化治療方案，改善患者預后有積極意義。

CCR6是CC趨化因子配體20(CC chemokine ligand 20,CCL20)的受體，二者相互作用可促進腫瘤免疫逃逸、血管生成及細胞遷移、增殖、炎性反應[11-13]。研究發現，CCR6在結直腸癌中表達水平較高，其可能通過促進上皮間質轉化進而在結直腸癌發展及肝轉移中發揮促進作用[14]；另外，CCR6在肝細胞癌中呈高表達，與不良預后有關，其是影響肝細胞癌患者預后的獨立危險因素，具有判斷肝細胞癌患者預后情況的潛在價值[15]。以上研究表明，CCR6可能在多種腫瘤發病進展中起促癌作用。本研究中NPC組織CCR6蛋白陽性表達率高于癌旁正常組織，提示CCR6可能與NPC發生發展有關，分析原因，一方面，高表達CCR6可能通過與其配體CCL20結合，激活炎性信號通路，促進血管生成，促進腫瘤發生，另一方面高表達CCR6可能與CCL20結合后，增加對NPC細胞遷移、增殖、上皮細胞間質轉化的作用，調節巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞分泌細胞因子或逃逸[16]，從而促進NPC發展，但具體機制有賴深入探究。進一步探究顯示，NPC組織CCR6蛋白表達水平與腫瘤淋巴結轉移、TNM分期、分化程度相關，提示CCR6與NPC病情進展相關，可能在NPC發生發展中具有促癌作用。

p38是一種蛋白質，分子量為38 KDa，刺激因子可促進P38酪氨酸和蘇氨酸雙磷酸化，P38被激活，促使P38進入細胞核，影響轉錄因子活性及細胞結構變化，調節信號通路有關基因轉錄、蛋白表達，在腫瘤血管生成、細胞生長、凋亡、分化、炎性反應等過程中發揮重要作用[17,18]。研究發現，p38在胰腺癌中呈異常表達，其可能通過影響血管生成、胰腺癌遷移、侵襲，從而影響胰腺癌發病進程[19]；另外，甘草查爾酮A可通過影響P38信號通路進而影響NPC細胞凋亡，P38可能在NPC病理發展中發揮重要作用[20]；且Farhat等[6]研究發現NPC患者P38呈過表達，具有判斷NPC臨床分期的潛在價值。以上研究表明，P38可能與NPC病變過程密切相關。本研究中NPC組織P38蛋白陽性表達率較高，提示P38可能在NPC中具有重要作用，推測P38過表達可能通過影響信號轉導、細胞遷移、異常增殖、遷移、血管生成等過程進而在NPC發生發展中起作用，其機制有待結合基礎研究證實。本研究顯示，NPC組織P38蛋白表達水平隨腫瘤淋巴結轉移、TNM分期增高、分化程度降低而升高，提示P38與NPC疾病發展相關，測定鼻咽組織P38表達水平有助于確定NPC患者病情嚴重程度，確定治療方案。

本研究中NPC患者癌組織中CCR6表達水平與p38呈正相關，提示CCR6可能與p38共同影響NPC病變進程，推測CCR6可能與CCL20結合，激活P38信號通路，影響NPC發生發展，但具體機制仍需深入探討。進一步研究發現，CCR6陽性組、p38陽性組NPC患者術后36個月總生存率明顯低于CCR6陰性組、p38陰性組，提示CCR6、p38與NPC患者預后相關，CCR6、p38表達水平越高，NPC患者預后可能越差，兩者有望成為臨床評估NPC患者預后的指標。另外，本研究發現，淋巴結轉移、p38、TNM分期、CCR6是影響NPC患者預后的獨立危險因素，提示淋巴結發生轉移、TNM分期越高、CCR6、p38表達水平升高均可能會使NPC患者發生不良預后風險升高，及時測定鼻咽組織CCR6、p38表達水平可能有利于及早診治、評估NPC預后。

綜上所述，CCR6、p38在NPC患者癌組織中均呈高表達，兩者均可能在NPC中發揮一定作用，且CCR6、p38可作為評估NPC患者預后的標志物。后期仍需深入探究CCR6、p38在NPC中的作用機制，為臨床診治NPC提供新靶點，增加說服力。