重組人干擾素α-1b聯(lián)合布地奈德對呼吸道合胞病毒感染大鼠血清、肺泡灌洗液白介素-4水平的影響

董偉然 張燕 安會波 葛勝旺 周亮

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)為副黏液病毒科RNA病毒，經(jīng)接觸和空氣飛沫傳播，是引起<5歲兒童急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infection,ALRTI)最重要的病毒病原[1]。RSV引起呼吸道感染的機(jī)制復(fù)雜，其中免疫功能紊亂這一發(fā)病機(jī)制已達(dá)成共識，RSV感染機(jī)體后，輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)/Th2 細(xì)胞功能失衡，呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢免疫應(yīng)答，Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子表達(dá)水平升高，生成的免疫球蛋白E(IgE)可導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞增殖，加重呼吸道炎癥，其中白介素-4(IL-4)作為Th2細(xì)胞的重要驅(qū)動因子在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，故降低IL-4水平，對RSV感染有治療作用[2]。目前RSV感染的主要治療包括一般治療和藥物治療，藥物治療主要包括抗病毒藥物干擾素、利巴韋林，支氣管舒張劑、糖皮質(zhì)激素、高滲鹽水、白三烯受體拮抗劑、抗菌藥物等。布地奈德具有高效局部抗炎作用的糖皮質(zhì)激素，霧化吸入后，可在肺部長時(shí)間保持較高濃度發(fā)揮局部抗炎作用，是RSV感染患兒的常用藥物。重組人干擾素α-1b是經(jīng)健康人白細(xì)胞干擾基因表達(dá)與克隆基因工程研制的干擾素，有抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用，用于病毒感染[3]。本研究探討重組人干擾素-α1b聯(lián)合布地奈德霧化對RSV感染大鼠血清、肺泡灌洗液白介素-4(IL-4)的影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康Wistar幼齡大鼠(8周左右)，體重(200±20)g，雌雄各半，無特定病原體(SPF)級，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[經(jīng)營許可證編號：SCXK(京)200220043]。

1.2 藥物與試劑 RSV Long株毒液由上海病毒所提供；IL-4酶聯(lián)免疫吸附法(Elisa)試劑盒，由上海江萊生物科技有限公司提供。重組人干擾素-α1b注射液(北京三元基因藥業(yè))、吸入用布地奈德混懸液(阿斯利康藥業(yè))均由河北省兒童醫(yī)院藥房提供。

1.3 分組與建模

1.3.1 分組：大鼠均置于清潔無病原體的鼠籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)，室內(nèi)相對濕度為40%～60%，溫度保持在(20±2)℃，晝夜光照節(jié)律維持12 h∶12 h，自由飲水、飲食，飼養(yǎng)1周后依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，分為空白對照組、陽性對照組、干擾素聯(lián)合布地奈德組、布地奈德組，每組8只。

1.3.2 建模：按照相關(guān)文獻(xiàn)[4]參考下建立RSV感染大鼠模型：除空白對照組外，其他3組在7%水合氯醛聯(lián)合七氟烷麻醉下均經(jīng)鼻腔接種RSV Long株毒液，0.1 ml/只，空白對照組在同等條件下接種等量不含RSV Long株毒液的0.9%氯化鈉溶液，0.1 ml/只，1次/d，連續(xù)接種3 d。若大鼠出現(xiàn)寒戰(zhàn)、發(fā)熱、豎毛、厭食、蜷臥、流涕、呼吸頻率加快等提示造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)藥物配置與給藥 參照臨床霧化給藥濃度配置：從實(shí)驗(yàn)第4天開始，空白對照組、陽性對照組分別按10 g/kg給予0.9%氯化鈉溶液水霧化干預(yù)，干擾素聯(lián)合布地奈德組大鼠按重組人干擾素-α1b注射液15 μg/次、吸入用布地奈德混懸液0.5 mg/次[5]霧化干預(yù)，布地奈德組大鼠按吸入用布地奈德混懸液0.5 mg/次霧化。每組大鼠均定點(diǎn)霧化2次/d，連續(xù)5 d。

1.5 檢測指標(biāo)與方法

1.5.1 標(biāo)本取材：治療結(jié)束后取4組大鼠眼球靜脈血2 ml置于試管中，低溫離心10 min取血清，于-40℃冰箱保存血清檢測細(xì)胞因子；取1.5 ml 0.9%氯化鈉溶液3次灌洗每只大鼠后取肺泡灌洗液1.5 ml，保存于-40℃冰箱檢測細(xì)胞因子。

1.5.2 IL-4檢測：雙抗體夾心ELISA法檢測4組大鼠血清、肺泡灌洗液中IL-4水平，按試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠治療后血清IL-4水平含量比較 染毒各組(陽性對照組、布地奈德組、干擾素聯(lián)合布地奈德組)與空白對照組相比，血清中IL-4含量均有明顯升高(P<0.05)。接受治療各組(布地奈德組、干擾素聯(lián)合布地奈德組)與陽性對照組相比，血清IL-4均有顯著下降(P<0.05)，且布地奈德組與干擾素聯(lián)合布地奈德組2組組間血清IL-4之間呈邊緣顯著性(P=0.058)，干擾素聯(lián)合布地奈德組血清IL-4水平低于布地奈德組。見表1、2。

表1 4組大鼠治療后血清IL-4水平含量比較

2.2 4組大鼠治療后肺泡灌洗液中IL-4水平比較 染毒3組(陽性對照組、布地奈德組、干擾素聯(lián)合布地奈德組)與空白對照組相比，肺泡灌洗液中IL-4含量均有明顯升高(P<0.05)。接受治療各組(布地奈德組、干擾素聯(lián)合布地奈德組)與陽性對照組相比，肺泡灌洗液中IL-4均顯著下降(P<0.05)，且布地奈德組與干擾素聯(lián)合布地奈德組2組組間肺泡灌洗液中IL-4比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，干擾素聯(lián)合布地奈德組肺泡灌洗液中IL-4水平低于布地奈德組(P<0.05)。見表3、4。

表2 染毒3組與空白對照組血清IL-4含量比較 n=8

表3 4組大鼠治療后肺泡灌洗液中IL-4水平比較

表4 染毒3組與空白對照組肺泡灌洗液中IL-4含量比較 n=8

3 討論

RSV主要是通過口、鼻呼吸進(jìn)入氣管和肺內(nèi)，進(jìn)而感染侵襲支氣管上皮細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞死亡，同時(shí)可引起呼吸道內(nèi)黏液分泌增多，阻塞管腔而引起呼吸困難。目前，RSV感染呈是世界范圍內(nèi)引起<5歲兒童罹患細(xì)支氣管炎、肺炎等下呼吸道感染的最重要病毒病原之一，也是導(dǎo)致<1歲罹患急性下呼吸道感染嬰兒住院的首要病毒因素，臨床主要癥狀表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、發(fā)熱、喘憋、呼吸困難等，嚴(yán)重者甚至可引發(fā)呼吸窘迫并發(fā)心力衰竭，嚴(yán)重威脅患兒生命健康[6]。宋士利等[7]研究顯示RSV檢出率與患兒的年齡呈負(fù)相關(guān)，其中0～1歲和1～2歲的嬰幼兒年齡組檢出率最高,分別為15.2%和12%，此外RSV感染流行還有明顯的季節(jié)性,每年冬季和春季是RSV感染的高峰期。

IL-4具有多種生物學(xué)作用，而作為一種細(xì)胞因子IL-4還又誘導(dǎo)幼稚輔助性T細(xì)胞(Th0細(xì)胞)分化為Th2細(xì)胞，通過IL-4激活后的Th2細(xì)胞又可在正反饋回路中刺激產(chǎn)生更多的IL-4。研究表明，IL-4對B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等都有調(diào)節(jié)功能，在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用[8]。同時(shí)IL-4還可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活性，促進(jìn)將B淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能[8]。RSV感染后可引起機(jī)體免疫功能紊亂，刺激Toll樣受體3(TLR3)和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)mRNA表達(dá)水平的升高，Th1/Th2 細(xì)胞功能失衡，并呈現(xiàn)Th2優(yōu)勢免疫應(yīng)答狀態(tài)，導(dǎo)致Th2細(xì)胞因子IL-4分泌增多，抑制Th1細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的生成，促進(jìn)RSV感染導(dǎo)致的TSLP mRNA高表達(dá)水平，加重炎性反應(yīng)[9]。同時(shí)IL-4還是人體主要促炎性細(xì)胞因子之一，能夠通過誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgE和粘蛋白表達(dá)，使黏液分泌水平明顯升高而阻塞呼吸道，也可誘導(dǎo)單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞等參與氣道炎性反應(yīng)，而誘發(fā)氣道的高反應(yīng)性，參與了RSV毛細(xì)支氣管炎的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。

彭智等[10]研究證實(shí)，RSV感染患兒的血清IL-4水平顯著升高，且升高程度與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。張明智等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IL-4在RSV毛細(xì)支氣管炎的發(fā)病過程中起重要作用，而IL-4基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性又與RSV毛細(xì)支氣管炎的易感性和病情嚴(yán)重度密切關(guān)系，攜帶IL-4的-589TT基因型和-33TT基因型患兒的患病率更高，臨床表現(xiàn)也更嚴(yán)重。本研究結(jié)果也顯示，染毒各組大鼠造模后血清及肺泡灌洗液中IL-4的水平明顯較空白對照組水平升高，與前述學(xué)者的研究論點(diǎn)一致。

重癥RSV感染在全球造成了巨大的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，但臨床上應(yīng)對RSV感染的治療方法仍相當(dāng)有限[12]。目前，尚無抗RSV疫苗及有效的抗病毒藥物，唯一可用于RSV預(yù)防的人源化特異性抗體帕利珠單抗尚未引進(jìn)國內(nèi)臨床應(yīng)用，因此臨床多以對癥及支持治療為主。常規(guī)對癥治療方法在一定程度能夠減輕癥狀，但對炎癥、免疫功能的改善作用較差；重組人干擾素α-1b具有廣譜抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，已經(jīng)成為兒科臨床治療毛細(xì)支氣管炎、病毒性肺炎、病毒性腸炎、手足口病等多種病毒性疾病的常用藥物。劉丹等[13]研究結(jié)果顯示聯(lián)合干擾素α-2b治療后可明顯促進(jìn)患兒發(fā)熱、喘息、肺部啰音及咳嗽等癥狀的消失，降低IL-4及活性蛋白D(SP-D)水平，升高轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)水平，具有調(diào)節(jié)免疫、抑制炎性反應(yīng)的功能，從而減輕病毒感染所致的氣道黏膜損害。

吸入型糖皮質(zhì)激素治療是RSV 感染有效的治療措施之一，布地奈德具有良好的局部抗炎效果，能夠增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、溶酶體膜的穩(wěn)定性，減少組胺等致炎致敏介質(zhì)和細(xì)胞因子的生成釋放，并降低其活性，并能收縮擴(kuò)張的黏膜血管，提高支氣管平滑肌對β2激動劑的敏感性，從而有效改善RSV感染毛細(xì)支氣管炎的臨床癥狀，減輕氣道炎性反應(yīng)，預(yù)防RSV感染后哮喘的發(fā)生[14]。吉大章等[15]探討吸入糖皮質(zhì)激素(布地奈德)治療兒童RSV感染相關(guān)喘息的作用機(jī)制，認(rèn)為布地奈德可通過與糖皮質(zhì)激素受體相結(jié)合，誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)調(diào)亡，抑制IL-6、IL-8表達(dá)，上調(diào)IL-10水平，影響了參與炎性反應(yīng)的一些基因轉(zhuǎn)錄，從而抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，改善喘息癥狀。陳愛萍[16]則通過對比RSV感染患兒出院后是否持續(xù)給予小劑量布地奈德霧化吸入治療，觀察RSV感染后布地奈德霧化吸入時(shí)效對反復(fù)喘息發(fā)作的影響，治療結(jié)果顯示持續(xù)給予小劑量布地奈德霧化吸入治療的患兒在1年內(nèi)的喘息發(fā)作次數(shù)和呼吸道感染次數(shù)明顯少于未持續(xù)治療的患兒。

我們將重組人干擾素α-1b聯(lián)合布地奈德應(yīng)用于RSV感染的治療，一方面借助干擾素的廣譜抗病毒效應(yīng)，抑制宿主細(xì)胞中病毒mRNA的傳遞和蛋白合成，阻止病毒的裝配與釋放，可直接降低病毒載量，另一方面借助布地奈德的抗炎作用，抑制免疫反應(yīng)，降低抗體合成，減少炎性因子的釋放，減輕氣道的高反應(yīng)狀態(tài)，有效減低氣道阻力，改善肺功能水平，夠達(dá)到更佳的治療效果。并且采用霧化吸入的方法，具有操作簡單、無創(chuàng)傷、安全性好等優(yōu)點(diǎn)，患兒及家屬接受度高，更佳適合小兒的治療。范增婧[17]研究結(jié)果顯示布地奈德聯(lián)合重組人干擾素α-1b可以有效提高臨床療效，不僅可以促進(jìn)患兒喘憋等癥狀的緩解，還能有效縮短患兒的住院時(shí)間，有效節(jié)省醫(yī)療資源，同時(shí)也減輕了家庭和社會的負(fù)擔(dān)。

本研究結(jié)果顯示，陽性對照組治療后血清、肺泡灌洗液IL-4水平較空白對照組均顯著升高(P<0.05)，而干擾素聯(lián)合布地奈德組和布地奈德組經(jīng)過相對應(yīng)藥物干預(yù)治療后，血清、肺泡灌洗液IL-4水平較陽性對照組顯著降低(P<0.05)，且干擾素聯(lián)合布地奈德組血清、肺泡灌洗液IL-4的水平較布地奈德組更低(P<0.05)；該結(jié)果提示重組人干擾素α-1b與布地奈德聯(lián)合應(yīng)用，具有更強(qiáng)的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，從而發(fā)揮積極的治療作用。

綜上所述，重組人干擾素α-1b聯(lián)合布地奈德霧化治療RSV感染大鼠療效確切，其作用機(jī)制可能與降低IL-4水平，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制炎性反應(yīng)有關(guān)，且霧化給藥方式安全易接受，藥物不良反應(yīng)小，在臨床應(yīng)用中是一種可靠、有效的治療方案。