Toll 樣受體4信號通路在纖維化中的研究進展

陳俊利 裴明 周豪坤 張皞昊 唐令

纖維化是疾病發展的最后階段,肌成纖維細胞在慢性炎癥作用下過度沉積細胞外基質(ECM)，可引起組織瘢痕及硬化，導致組織器官實質細胞減少、纖維結締組織增生，最終可發展為器官衰竭甚至死亡[1,2]，而目前臨床上還沒有防治纖維化的特異性治療方法。纖維化發生機制涉及到包括炎癥、氧化應激、凋亡以及多種細胞因子作用等方面，其中炎性反應對纖維化的發生發展進程有重要影響，持續存在的炎性反應介導成纖維細胞激活、增殖、分化為肌成纖維細胞，從而促進纖維化的病理發展[3]。Toll樣受體4(TLR4)作為膜識別受體，可識別病原相關分子模式(PAMPs)和損傷相關分子模式(DAMPs)，與中間接頭蛋白結合，活化轉錄因子，參與組織急慢性炎性反應，介導纖維化的發生發展[4]。本文描述TLR4的結構及與其他信號轉導通路的相互作用，探討TLR4在纖維化疾病中的作用，闡明以TLR4信號通路為治療靶點的相關應用研究，總結如下。

1 TLR4信號通路概述

1.1 TLR4的結構 TLRs家族有11個成員，其中TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6 和TLR11在細胞表面表達，主要識別微生物膜成分；TLR3、TLR7、TLR8和TLR9 表達在細胞內囊泡，主要識別微生物的核酸[5]。其中TLR4是最早被人類發現的TLRs相關蛋白，TLR4通過識別真菌和病毒的細胞壁成分，而發揮模式識別和信號傳導的作用[6]。TLR4屬于一種跨膜受體蛋白，其結構主要有富含亮氨酸重復序列的胞外區、跨膜區和胞內區三部分。胞外區通過特異識別PAMPs和DAMPs來建立免疫反應；胞內區含Toll/白細胞介素1受體(TIR)結構域，TIR結構域是TLR4信號通路的關鍵區域，可激活下游適配器蛋白；跨膜區則富含半胱氨酸[7]。

1.2 TLR4信號通路的激活 TLR4信號通路的激活包括兩條途徑，(1)髓樣分化因子88(MyD88)依賴信號途徑，此為TLR4信號傳導的經典途徑，可通過介導核因子κB(NF-κB)而誘導炎性因子的釋放[6]；(2)MyD88非依賴信號途徑。見圖1。

圖1 TLR4信號轉導通路

MyD88依賴信號通路是通過TLR4受體與與相應的配體相結合，TLR4的經典配體是脂多糖(LPS)，將信號轉導至細胞內部[8]；細胞漿TIR結構域與TIR結構域包含的接頭蛋白MyD88發生相互作用，使MyD88與IL-1受體相關激酶4(IRAK-4)作用，使IL-1受體相關激酶1(IRAK-1)磷酸化，接著活化腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)，然后刺激TGF-β活化激酶1(TAK-1)，從而激活IκB激酶(IKK)，導致絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和NF-κB的啟動，進而活化轉錄因子，通過核內啟動信號轉導，促進各種炎性細胞因子表達激活。MyD88非依賴通路主要通過激活TIR結構域銜接蛋白(TRIF)和腫瘤壞死因子受體相關分子3(TRAF3)，導致IKKε/TBK1的募集，經過干擾素調節因子3(IRF-3)的磷酸化及激活NF-κB的表達來實現，從而促進各種炎性反應的發生[9-11]。

2 TLR4信號通路與其他信號轉導通路的相互作用

2.1 PI3K/Akt信號通路 PI3K/Akt信號通路失調在臨床可見于多種疾病，包括癌癥、糖尿病、心血管疾病和纖維化疾病等，研究結果顯示，該信號通路在調控各種不同細胞功能(包括代謝、生長、增殖、存活、轉錄以及蛋白質合成)方面發揮重要作用，是人類疾病治療的重要靶標[12]。Zhang等[13]發現白藜蘆醇能顯著降低肝星狀細胞TLR4和MyD88蛋白的表達及PI3K和Akt的表達，顯著抑制LPS誘導的肝星狀細胞中NF-κB的轉運，認為藥物機制是通過阻斷NF-κB激活和PI3K/Akt磷酸化來抑制肝星狀細胞活化，從而阻斷肝纖維化。Wang等[14]通過建立體內小鼠單側輸尿管梗阻(UUO)模型，體外用TGF-β1和LPS刺激人腎近端小管上皮細胞(HK-2)，形成上皮間質轉化(EMT)和炎性反應，觀察姜黃素對腎間質纖維化(RIF)的作用機制，得出結論姜黃素通過抑制TLR4/NF-κB和PI3K/AKT通路抑制了EMT和炎性反應，對RIF的治療具有潛在應用價值。

2.2 TGF-β1/Smad信號通路 TGF-β家族由一類結構、功能相關的多肽生長因子亞家族組成，廣泛存在于從果蠅到人多種生物的各種組織中，影響細胞的增殖、分化，在胚胎發育、胞外基質形成、骨的形成和重建等方面起著重要作用。Lin等[15]通過體內體外實驗發現穿心蓮內酯(Andro)治療不僅能降低小鼠促纖維化和促炎因子的表達，還能阻斷TGF-β1/Smad2和TLR4/NF-κB p50信號通路，表明Andro可預防肝臟炎癥和纖維化，與抑制TGF-β1/Smad2和TLR4/NF-κB p50通路的表達有關。Cáceres等[16]研究發現重組人松弛素-2(serelaxin)通過靶向TLR-4和NLRP3炎癥小體抑制心肌成纖維細胞TGF-β1/IL-1β軸，發揮著抗纖維化作用。

2.3 MAPK信號通路 絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一組進化保守的絲/蘇氨酸蛋白激酶，可被細胞外的信號激活，并介導信號從細胞膜向細胞核傳導，在許多細胞活動中起重要作用，如生長增殖、細胞分化或細胞運動。MAPK信號通路通過細胞機制調控人體多種生理活動，如炎癥、凋亡、腫瘤細胞的侵襲和轉移等[17]。Li等[18]通過體內和體外模型探討了紅景天(Sal)對RIF的機制，研究發現，Sal改善了小鼠腎功能，減輕ECM成分的沉積，降低小鼠腎臟和HK-2細胞中EMT標記物的蛋白水平，顯著降低炎性細胞因子的釋放，并抑制TLR4/NF-κB和MAPK信號通路。Kang等[10]評估了小鼠飲食誘導肥胖(DIO)模型中與慢性間歇性缺氧(CIH)相關的肝臟炎癥的機制，檢測血清和肝臟中相關炎癥和氧化應激標志物，得出結論，CIH在DIO小鼠中通過TLR4/MyD88/MAPK/NF-kB信號通路導致了肝纖維化。

3 TLR4在纖維化疾病中的應用研究

3.1 TLR4與腎纖維化 腎纖維化是慢性腎臟病進展至終末期腎病重要的病理改變，是腎臟功能不斷損傷的結果[19]。腎纖維化以ECM的異常沉積為特征，主要表現為炎性細胞浸潤和炎性介質的釋放、成纖維細胞的活化和增殖，持續存在的炎性反應介導了腎纖維化的發生發展[20,21]。TLR4及其信號通路在腎臟受損時被激活，引起炎性因子、趨化因子的分泌、巨噬細胞表型轉化及氧化應激，致使ECM分泌增加。TLR4及其信號轉導通路在腎臟炎癥應答及促進腎纖維化中發揮重大作用[7]。

有數據表明，TLR4在慢性間歇性低氧誘導的腎損傷、炎癥和纖維化中發揮了重要作用[22]。周細胞中MyD88及其下游效應因子IRAK-4的信號是腎臟炎癥和纖維化形成的重要驅動因素[23]。而阻斷MyD88依賴通路可能是抑制纖維形成和促進再生的潛在治療方法[24]。研究發現黃芪甲苷可通過下調TLR4/MyD88依賴信號通路，減少下游炎性因子TNF-α、IFN-γ和IL-6的釋放，來改善小鼠缺血再灌注或單側輸尿管梗阻所致的腎纖維化[25,26]。Liu等[27]發現尿酸通過激活TLR4/NF-κB信號通路誘導腎小管上皮細胞發生上皮間充質轉變，靶向干預TLR4/NF-κB信號通路可有效抑制尿酸介導的腎間質纖維化。

3.2 TLR4與肝纖維化 肝纖維化是肝臟結締組織異常增生的病理生理過程，若機體持續出現肝損傷，肝纖維化可進一步發展為肝硬化甚至肝癌[28,29]。肝星狀細胞(HSC)是引起肝纖維化瘢痕組織的主要細胞，HSC活化后轉為肌成纖維細胞，釋放大量ECM[30,31]。HSC作為肝纖維化發病的關鍵環節，因此，對HSC的干預成為治療肝纖維化的重要措施。肝纖維化與炎性反應之間關系緊密[32]。TLR4作為炎性反應觸發器，對HSC的激活發揮重要作用，是各種損傷因素所致肝纖維化的主要調節子[33]。

有研究表明，慢性間歇性缺氧通過TLR4/MyD88/MAPK/NF-κB信號通路誘導了肥胖小鼠肝纖維化[10]。Lai等[8]研究發現青蒿琥酯可抑制大鼠LPS/TLR4/NF-κB信號途徑，下調α-SMA和TGF-β1的蛋白水平，減輕炎癥誘導的肝纖維化。王海蘭等[34]發現川芎含藥血清可抑制LPS誘導的HSC中TLR4及MyD88的表達而發揮其抗纖維化的作用。Hu等[35]發現連翹脂素可通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制LPS誘導的炎性反應，抑制LX2細胞活化和肝纖維化細胞因子的表達。

3.3 TLR4與肺纖維化 肺纖維化是正常肺泡組織持續性被損傷，成纖維細胞增殖、ECM過度積聚引起肺組織結構不可逆性破壞而形成瘢痕[36]。肺纖維化是一種漸進性、不可逆性的間質性肺疾病，是機體對肺臟損傷的過度修復，在疾病終末期可導致呼吸衰竭[37]。其中，肺纖維化的重要病理基礎是持續的損傷介導了炎性反應的產生。TLR4與相關配體結合，參與了細胞的信號轉導、誘導自噬和調節炎性反應等，進而調控肺纖維化的發生發展[9]。

TLR4參與肺纖維化的發生發展及調控大鼠肺成纖維細胞的炎性反應[38]。Jia等[39]發現芒果苷通過抑制TLR4的激活，阻斷p65和Smad2/3的磷酸化同時降低MMP-9的表達，明顯抑制了炎性細胞因子的分泌和EMT形成過程，從而減弱博來霉素(BLM)誘導的小鼠肺纖維化。Tao等[40]研究表明羅漢果苷IIE通過調節TLR4/MyD88-MAPK信號通路，以抑制肺部炎癥和ECM沉積，從而顯著抑制肺纖維化。Li等[41]研究發現人胎盤間充質干細胞可以減少羥脯氨酸(HYP)沉積量、MyD88和TGF-β信號的激活以及促纖維化細胞因子的產生，可顯著減輕BLM誘導的小鼠肺纖維化。

3.4 TLR4與心肌纖維化 心肌纖維化指心臟成纖維細胞增殖，ECM過度沉積伴膠原蛋白比例失調及排列紊亂，影響心肌彈性及心輸出量，引起供血障礙而導致心功能不全的病理改變[42]。心肌纖維化是誘發或加重多種心血管疾病的重要病因，也是心血管疾病發展至終末期的病理表現，可引起心舒縮功能障礙，導致心律失常、心力衰竭，甚至心源性猝死等[43,44]。心肌纖維化的參與因素主要有腎素-血管緊張素-醛固酮系統、氧化應激與炎性反應、多種生物活性因子等，其中，炎性反應在心肌纖維化中發揮了重要作用[43]。TLR4是介導心肌炎癥的重要信號分子，其活化后可通過信號轉導通路引起一系列因子表達，進而促進心肌纖維化的發生發展[45]。

萬琦等[46]研究發現下調miR-125b可通過抑制TLR4/NF-κB信號途徑減少炎性因子的分泌，從而抑制心臟成纖維細胞的增殖，減緩心肌纖維化、心肌重構及心力衰竭的進程。Ma等[47,48]研究提示異甘草酸鎂及藏紅花素通過抑制TLR4/NF-κB信號通路對異丙腎上腺素(ISO)誘導的心肌纖維化有保護作用。趙浩茜等[49]研究結果提示有氧運動通過抑制高血壓大鼠心肌中的HMGB1/TLR4信號通路，從而抑制心肌中炎性因子IL-6、TNF-α的激活，以改善心肌纖維化重構。石亞男等[45]研究表明羅漢果苷ⅢE通過調控TLR4信號通路，抑制了炎性介質及促纖維化因子的激活，從而阻抑心肌纖維化的發生發展。

3.5 TLR4與腹膜纖維化 腹膜纖維化是長期腹膜透析(PD)使腹膜形態及功能的改變，引起腹膜超濾及轉運功能衰竭，PD患者被迫結束透析治療[50]。腹膜纖維化的基本特征是ECM的過度積累、腹膜間皮細胞凋亡及新生血管生成等[51]。尿毒癥、生物不相容的腹膜透析液[高糖、低pH值、葡萄糖降解產物(GDP)和晚期糖基化終末產物(AGEs)]及腹膜炎是引起腹膜纖維化的重要因素。而腹膜炎癥是腹膜纖維化發展過程中的關鍵事件[52]。調控TLR4信號轉導通路可抑制促炎細胞因子和纖維化介質的釋放，在腹膜炎癥中起重要作用[53]。

TLR4是腹膜透析相關性纖維化的潛在治療靶點[54]。Choi等[53]研究發現抑制TLR4可降低高糖誘導的MyD88、NF-κB p65、TGF-β等蛋白的表達，得出結論，高糖誘導人腹膜間皮細胞炎癥和纖維化標志物的部分途徑是通過TLR4/MyD88/NF-κB信號通路，證明了TLR4可能是改善腹膜透析后腹膜炎癥和纖維化的治療靶點。Shao等[55]探討了薯蕷皂苷對LPS誘導的腹膜纖維化的影響，結果發現薯蕷皂苷抑制了EMT形態學改變，降低了纖維化標志物和炎性因子的表達，通過降低TLR4、MyD88、NF-κB的表達，從而抑制EMT和纖維化。

4 以TLR4信號通路為治療靶點的研究

4.1 TLR4抑制劑 TAK242是TLR4信號的小分子抑制劑，TAK242在TLR4的胞內區域與Cys747結合，并破壞TLR4與適配器分子的相互作用，從而達到選擇性地抑制TLR4信號的目的。Bhattacharyya等[56]檢測了TAK242在臨床前纖維化模型和系統性硬化癥(SSc)成纖維細胞中的作用，發現經由TAK242治療，可減輕患者博萊霉素誘導的皮膚病變和體內肺纖維化的程度，并可降低幾種促纖維化介質的表達。此外，還發現TAK242改善了TSK/+小鼠的腹膜纖維化和降低腹膜厚度，阻斷了膠原合成和肌成纖維細胞分化。研究確定了TAK242在器官纖維化的臨床前模型中是一種抗纖維化藥物，是一種治療SSc和其他纖維化疾病的新策略。

4.2 MyD88抑制劑 筆者發現目前MyD88抑制劑相關研究較少。Liu等[57]通過合成一種靶向MyD88的新型抑制劑(TJ-M2010-2)，該抑制劑可以結合MyD88的TIR域并干擾MyD88的二聚反應，文中探討了TJ-M2010-2在缺血再灌注損傷(IRI)誘導的RIF中的作用機制，研究結果發現，TJ-M2010-2可阻斷TGF-β1誘導的HK-2細胞的EMT，明顯抑制TRAF6、p65和Snail的表達，上調IκBα的表達，表明MyD88抑制劑可能是一種改善RIF潛在的治療藥物。

4.3 抗人TLR4單克隆抗體 單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，具有靶向性強，毒副作用低、特異性高等特點。近年來，治療性單克隆抗體在抗腫瘤、阻斷信號傳導、靶向治療等領域獲得廣泛的應用，是藥物治療新的發展方向。Cai等[58]通過研究發現人源化抗TLR4單克隆抗體在mRNA和蛋白水平上阻斷了炎性細胞因子的表達，Fab片段顯著抑制NF-κB信號通路，從而導致p38、ERK1/2、JNK1/2的抑制。研究結果表明，抗人TLR4單克隆抗體可以通過阻斷小鼠腹腔巨噬細胞中TLR4信號通路，有效地保護小鼠免受LPS誘導的免疫應答。

綜上所述，在多種器官及組織纖維化的發生發展過程中，TLR4信號轉導通路與纖維化疾病有著密切聯系。通過干預TLR4信號通路，可以抑制炎性細胞因子和促纖維化因子的分泌，進而抑制纖維化病變。但由于TLR4的相關信號通路比較多，對纖維化的具體影響機制比較復雜，仍然需要對其進行深入探尋。隨著今后相關研究的不斷增加，相信TLR4相關信號通路在纖維化疾病中的作用機制將會更加的明確，對TLR4信號通路表達進行干預，以期為臨床防治纖維化提供新的思路。