散發性腦動靜脈畸形KRAS突變及其與臨床特征的關系

李昊，許宏遠，押小龍，曹勇，2

腦動靜脈畸形（brain arteriovenous malformation，BAVM）臨床表現多樣，其中顱內出血是其最嚴重也是最常見的癥狀[1]。在BAVM中，顱內出血的年發病風險為2%～4%，相關死亡率約為10%[2-3]。針對散發性BAVM的研究發現BAVM組織中存在Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）激活型體細胞突變，突變率在28.5%～76.2%不等[4-8]，提示KRAS基因突變可能與BAVM的發生、發展存在一定關聯。此外，KRAS突變是否與BAVM的臨床特征有關還尚不清楚。因此，有必要進一步探究KRAS突變與BAVM發生之間的關系以及這些突變與患者臨床特征的關聯。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究采用回顧性分析的方法，連續納入2017-2019年就診于首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科的BAVM患者。納入標準：①經過DSA或CTA診斷為BAVM；②患者或家屬簽署知情同意并接受外科手術治療；③無BAVM家族史；④切除的病變部位進行了福爾馬林固定和石蠟包埋（formalin-fixation and paraffin-embedding，FFPE）處理且樣本保存良好。排除標準：①未接受手術治療；②接受外科手術治療但是不能獲取組織標本或標本未達到檢測標準；③家族性BAVM。

BAVM的診斷是依據DSA發現動靜脈畸形團和動靜脈分流，并且經過病理學檢查確診。從病歷資料中提取相關數據，包括入院年齡、性別、首發癥狀（包括腦出血、癲癇、頭痛、其他等）。根據術前頭顱MRI判讀BAVM的位置、最大直徑（矢狀位）、體積[計算公式：（長×寬×高）/2]。

1.2 DNA檢測 從5 μm的FFPE組織切片中提取DNA。將顯微組織切片與組織裂解緩沖液（Qiagen，Hilden）混合后，在98 ℃下熱處理15 min，然后在56 ℃下用蛋白酶K消化3 d。采用DNeasy組織血液試劑盒（DNeasy tissue and blood k it，Qiagen）提取DNA。使用NanoDrop ND-1000熒光光譜儀（NanoDrop，Wilmington，DE）對提取的DNA進行定量測定。通過PCR擴增KRAS的指定區域（檢測位點為chr12：25398284）。KRAS的PCR引物是使用Primer 3軟件的修改版本設計的，引物序列如下：正向，GGTCCTGCACCAGTAATATGC；反向，ATTAACCTTATGTGTGACATGTTC。用該引物擴增170～240 bp之間的產物。使用2步方案進行PCR擴增，在單個Hiseq泳道中將所有批次樣品的PCR產物一起測序。最后產物進一步進行超深度測序，使用之前開發的LEMONADE流程過濾篩選合格數據并檢測KRAS基因位點突變[9]。

1.3 統計分析 采用 Python 3.8進行統計分析，連續性變量符合正態分布，采用表示。分類變量采用例數和率表示，若分類表格中有頻數＜5，則采用Fisher確切概率，否則采用Pearsonχ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特點 本研究共納入145例BAVM患者，均為漢族，其中男性94例，女性51例，年齡3～61歲，以腦出血為首發癥狀者居多（48.3%）。只有1例患者在BAVM切除術前接受了血管內部分栓塞治療（表1）。

表1 臨床特征數據匯總

2.2KRAS突變檢測 145例樣本中有63例有KRAS體細胞突變，其中41例（28.3%）樣本檢測到c.35G→A（G12D）突變，14例（9.7%）樣本檢測到c.35G→T（G12V）突變。此外，還發現了其他研究很少報道的幾種KRAS突變，包括c.34G→T（G12C）突變8例（5.5%）、c.34G→A（G12S）突變7例（4.8%）、c.35G→C（G12A）突變2例（1.4%）、c.34G→C（G12R）突變1例（0.7%），其中有8例（5.5%）樣本包含1個以上的KRAS突變體。

2.3KRAS突變與BAVM臨床特征的關系KRAS突變組（63例）和非突變組（82例）的性別、年齡、首發癥狀（包括腦出血、癲癇、頭痛等）、病灶最大直徑、病灶體積之間的差異均無統計學意義（表2）。

表2 KRAS突變組與無突變組臨床特征比較

3 討論

KRAS屬于大鼠肉瘤病毒癌基因（rat sarcoma viral oncogene，RAS）家族，RAS是一種鳥苷三磷酸酶（guanosine triphosphatases，GTPase）開關信號蛋白，可以與鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）和鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）相結合，調控自身活動狀態。RAS基因突變會破壞鳥嘌呤切換周期，并將RAS蛋白“鎖定”在與GTP結合的功能狀態，從而激活下游信號通路[10-11]。有研究發現KRAS突變發生于BAVM組織的內皮細胞，主要通過激活腦血管內皮細胞中的有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外信號調節激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路損傷內皮細胞連接[4]。

散發性BAV M的發病機制目前尚不清楚，但是最近的一項研究發現74%（29/39）的病例存在KRAS激活型體細胞突變[4]。動物實驗發現，在小鼠內皮細胞中轉入Kras突變基因能誘發BAVM，提示KRAS體細胞突變可能是BAVM發生的原因之一，而且僅KRAS基因的突變就足以在體內引發BAVM，提示KRAS突變與BAVM的發生與發展密切相關[12]。內皮間質轉化是BAVM的重要病理特點，有研究顯示KRAS突變可導致內皮-間質轉化，推測內皮-間質轉化可能是KRAS突變導致BAVM形成的機制或因素之一[9]。

由于檢測技術、樣本類型、測序深度和患者種族等不同，不同研究所報告的KRAS突變率存在一定差異。Nikolaev等[4]使用全外顯子測序技術檢測突變頻率，將讀長超過0.5%的KRAS變異定義為突變閾值，結果發現46.2%（12/26）的BAVM患者存在相應變異，而采用微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）檢測，發現74.4%（29/39）的BAVM患者存在KRAS突變。研究者分析突變率差異的原因可能是由于讀長在基因組上的異質性分布使得特定KRAS點上的讀長覆蓋度較低，從而導致假陰性結果，而ddPCR能夠檢出＞0.1%突變閾值的基因，檢測的準確性相對較高[13]，另外，材料（包括新鮮樣品和FFPE樣品）的差異也可能影響KRAS突變的檢測結果[12，14]。本研究在比既往研究更大的樣本量中測定KRAS突變，結果發現43.4%（63/145）的BAVM患者存在KRAS突變，與既往研究數據相似。另外，本研究發現G12D突變是最常見的突變類型，也與既往多數研究一致[4-5，9]。此外，在本研究樣本量較大的優勢下，還發現了一些罕見報道的新的突變類型，如G12C和G12A。值得注意的是，針對G12C突變抑制藥物的試驗成功，提示KRAS等位基因特異性突變靶向治療的有效性[15-16]，本研究發現的一系列KRAS突變類型，為研發靶向突變藥物提供了可能的位點信息。

有多項研究探討了KRAS突變與BAVM患者臨床特征之間的關系[5，7]，但目前結論不一致。有研究者發現KRAS突變的病例多以出血為首發癥狀，還有研究者發現基因（包括KRAS和BRAF）的變異頻率與腦和脊髓動靜脈畸形病灶的體積呈負相關[5]。本研究未發現患者的臨床特征如性別、年齡、腦出血、癲癇、病變最大直徑和體積等指標與KRAS基因突變的關聯，可能與研究的入選標準、病理取材、檢測方式、樣本量差異等原因有關。

本研究存在以下不足：首先，本研究中的病變樣本是經過FFPE處理的BAVM組織，可能會導致基因檢測的準確性下降；其次，本研究僅在KRAS的突變熱點（chr12：25398284）附近擴增基因，可能錯過其他KRAS突變的位點；再次，本研究未針對發現的不同突變類型進一步分析其與臨床特點的關系。后續應進行前瞻性、更多樣本量的深入研究來探索KRAS突變與BAVM的病理機制、臨床表現的關系。

【點睛】本研究在較大樣本量FFPE處理的BAVM組織中發現KRAS突變較常見，除了既往常見的突變位點G12D和G12V外，還發現了既往少見報道的突變位點，特別是G12C和G12A，為研發靶向突變藥物提供了可能的位點信息。