木薯UGT41基因對細菌性枯萎病的抗性研究

曾 堅，謝雅倩，李寶瑩，張海涵，胡 偉

(1 韶關學院 英東生物與農業學院，廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室 廣東韶關 512005；2 中國熱帶農業科學院 熱帶生物技術研究所，海口 571101)

糖基化是植物體內針對天然化合物的一類常見修飾反應，修飾過程通過糖基轉移酶(glycosyl transferases, GTs)來完成[1-2]。GTs通過在底物分子上添加糖基來形成更加穩定的天然糖苷或糖酯。糖基供體主要是鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和木糖等。到目前為止，所有植物中都發現了糖基轉移酶的存在，證明了糖基轉移酶對植物的生長發育過程具有重要意義。在植物的進化過程中形成了龐大復雜的GTs家族，目前已鑒定得到的家族有110個(http://www.cazy.org/)。UDP依賴型糖基轉移酶 (UDP-glycosyltransferases, UGTs) 基因家族是一大類使用UDP活化糖基作為糖供體的GTs。

在植物的生物發育過程中，UGTs基因家族能夠對生物堿、類黃酮和植物激素等物質進行修飾從而實現相關調控[3-4]。UGTs基因家族在植物激素調節過程中具有重要作用。糖基化修飾可以影響植株中生長素的含量，例如過表達UGT84B1基因能夠提高轉基因植株中糖基化的生長素含量[5]。過表達UGT73C5和UGT73C6基因導致轉基因植株的油菜素類固醇途徑缺陷，表現出油菜素類固醇含量降低[6-7]。UGTs基因家族通過調控內源性ABA含量來參與植物非生物脅迫響應過程，例如UDP-葡糖基轉移酶基因UGT71B6及其2個高度同源的UGT71B7和UGT71B8基因，通過調節ABA的含量從而改變轉基因植株在逆境脅迫中的適應能力[8]。UGT71C5基因可通過糖酯化ABA來增加ABA的穩定性從而降低轉基因植株的耐旱性[9]。UGTs基因家族在植物的生物脅迫響應中也具有重要作用。在植物生物脅迫響應過程中，病原體的入侵通常會啟動水楊酸和茉莉酸介導的防御信號途徑，這兩條信號通路往往是以拮抗的方式來發揮作用[10-11]。研究表明，小分子進行糖基化修飾后能夠參與防御信號在植物中的傳遞，如UGT76B1基因被證明是聯系水楊酸和茉莉酸途徑的中間環節。過表達UGT76B1基因會降低水楊酸依賴型植物的病菌防御能力，提高茉莉酸依賴型植物的病菌防御能力。突變UGT76B1基因則會增強對丁香假單胞菌的防御能力，降低對壞死性銅斑病鏈球菌的防御能力[12]。

木薯(ManihotesculentaCrantz)是世界三大薯類之一，也是熱帶和亞熱帶地區重要的糧食作物和經濟作物，其地下塊根富含淀粉，是全世界約7億人口的主糧[13-14]。木薯對光、熱、水有較高的利用率，對人工管理需求較少，具有明顯的抗旱性，同時具有較高的淀粉產量，其優質淀粉不僅可以為人類提供碳水化合物，也可以用來生產工業酒精和飼料[13]。在木薯的病害中，由地毯草黃單胞菌 (Xamthomonasaxonopodispv.Manihotis,Xam) 引起的木薯細菌性枯萎病一直是造成國內外木薯生產中毀滅性損失的病害之一[15]。UGTs基因在非生物脅迫/生物脅迫中的功能已有部分研究[8, 12]，但其在木薯細菌性枯萎病中的生物學功能尚未揭示。因此，本研究通過克隆顯著受到Xam誘導表達的MeUGT41基因，構建MeUGT41基因的VIGS載體并轉化至木薯葉片中，對基因干擾植株在細菌性枯萎病中的抗性進行評價，以期為研究MeUGT41基因在木薯抵抗細菌性枯萎病過程中的抗病機理奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

木薯品種SC124 (Manihotesculentacv.SC124) 由中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所保存并提供。RNA提取和反轉錄試劑分別購自天根生化 (DP437) 和Fermentas (K1622)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 載體構建根據克隆得到的MeUGT41基因序列，設計引物構建干擾載體pTRV2-MeUGT41 (表1)。擴增片段長度為222 bp，然后連接至T載體進行測序，測序正確后酶切連接至pTRV2載體構建pTRV2-MeUGT41重組載體并轉化，隨后進行菌液PCR和提取質粒雙酶切驗證，全部正確后保留相應的菌液和重組質粒備用。

表1 載體構建引物和熒光定量引物

1.2.2 病毒誘導木薯MeUGT41基因沉默將單獨轉化pTRV2-MeUGT41和pTRV載體的2種農桿菌分別注射到木薯葉片中，植株侵染后，置于溫室并保持濕潤，侵染2周后收集相關植株的樣品提取RNA進行熒光定量PCR，檢測目的基因MeUGT41在相關植株中的相對表達量，引物見表1。

1.2.3Xam侵染和MeUGT41基因表達分析將Xam母液進行復蘇培養，取1 mL 復蘇后菌液接種至新配置的LB液體培養基，震蕩培養至OD600為0.6左右。使用MgCl2溶液稀釋菌液至OD600為0.4(MgCl2終濃度10 mmol/L)。將稀釋的菌液用注射器注射到木薯葉片，然后置于溫室中繼續培養，培養過程中注意保濕[16]。提取每個時間點處理葉片的總RNA，進行反轉錄，使用設計好的MeUGT41基因的定量引物進行熒光定量PCR，根據2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量。

1.2.4Xam細菌數目統計和葉片表型分析分別取侵染0 和6 d木薯葉片(打孔器)，樣品用無菌水漂洗3次，每次2 min，然后碾碎樣品。將碾碎的樣品進行稀釋 (濃度梯度為103～108)，不同濃度的樣品分別接種至LB平板(每個樣品取10 μL)，每濃度梯度重復3次。LB平板密封后置于恒溫培養箱培養 (28 ℃, 16 h)，培養結束后統計細菌數量，每個處理至少收集10個葉圓盤進行細菌數量統計。在0 和6 d時觀察表型變化并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 Xam 對MeUGT41基因表達的誘導

為分析MeUGT基因家族的功能，從GEO數據庫中下載相關轉錄組數據顯示MeUGT41基因受到Xam菌株的誘導[17]。進一步用Xam菌株處理木薯葉片，表達數據分析顯示處理葉片中的MeUGT41基因確實受到Xam處理的誘導。如圖1所示，葉片中MeUGT41基因的表達量在Xam侵染后被顯著提高并不斷上升，在7 d時達到峰值；相比對照0 d，MeUGT41基因的表達量在5 和7 d時分別提高了2.7和3.1倍。這些結果表明Xam菌株會誘導MeUGT41基因的表達。

2.2 構建pTRV2-MeUGT41干擾載體

根據MeUGT41基因序列選擇合適的片段構建干擾載體，隨后設計引物并擴增得到長度為222 bp的片段，雙酶切位點分別為EcoR Ⅰ和KpnⅠ，將擴增片段連接至T載體后進行測序驗證。測序正確后通過雙酶切將片段連接至載體pTRV2，得到pTRV2-MeUGT41重組干擾載體，通過菌液PCR和雙酶切對pTRV2-MeUGT41載體進行驗證(圖2)，結果表明，pTRV2-MeUGT41干擾載體構建成功。

2.3 病毒誘導MeUGT41基因沉默

通過VIGS誘導沉默木薯葉片中MeUGT41基因的表達來分析MeUGT41基因在木薯中的功能。據熒光定量PCR結果，共獲得3株陽性，分別命名為MeUGT41V-1，MeUGT41V-2和MeUGT41V-3，對照植株為TRV。相比TRV，3株陽性轉基因植株中的MeUGT41基因表達量均顯著降低，分別降低了64%、35%和53%(圖3)。這些結果表明，MeUGT41基因在木薯葉片中被明顯抑制。

2.4 MeUGT41基因沉默木薯葉片抗病性表現

為分析MeUGT41基因在木薯葉片中的抗病能力，在MeUGT41基因沉默的葉片和對照葉片上分別接種Xam菌株。如圖4所示，接種0 d時，細菌數在轉基因葉片和對照葉片上都沒有顯著差異；而接種6 d后，MeUGT41基因沉默植株葉片上的細菌數量較對照組顯著增加。干擾植株中MeUGT41基因的表達量最低的是植株MeUGT14V-1(圖3)，而細菌數量最少的也是植株MeUGT14V-1(圖4)，基因表達量和細菌數量之間沒有呈現明顯的對應關系。但從葉片表型圖可以看出，MeUGT41基因沉默葉片上的菌斑更明顯(圖5)。以上結果表明，抑制MeUGT41基因的表達降低了木薯葉片抵抗Xam病菌侵染的能力。

3 討 論

木薯是熱帶和亞熱帶地區大戟科木薯屬植物，其地下塊根富含淀粉，被譽為“地下糧倉”。木薯塊根不僅可以作為主糧，也可作為生產工業酒精和飼料的原料[13]。木薯細菌性枯萎病的致病菌是地毯草黃單胞菌，該病菌最初在拉丁美洲發現，現在已經傳播至全世界，曾經毀滅性打擊過多個國家的木薯產業。在中國木薯產區(廣西、廣東、海南)，也都發生過木薯細菌性枯萎病，嚴重危害中國木薯產業的發展[15]。

UGTs家族基因能夠通過糖基化修飾植物體內不同的天然化合物從而參與植物的生長發育過程。如通過糖基化修飾影響ABA、油菜素類固醇和生長素等物質的含量來調控植物的生長發育和響應非生物脅迫過程[5-8, 18]。也有研究報道指出UGTs基因參與調控植物中水楊酸和茉莉酸的含量來響應生物脅迫[12]。如ugt74f1擬南芥突變體植株中的水楊酸含量降低，突變體植株對病菌Pseudomonassyringae表現出易感性[19]；而ugt76b1擬南芥突變體則使得植株對病菌Alternariabrassicicola的抵抗力下降，而此時與茉莉酸相關的標記基因的表達量被明顯抑制[12]。在本研究中，對MeUGT41基因的蛋白序列進行比對分析發現，該基因和木薯中的MeUGT85K5，MeUGT85K4基因的蛋白序列高度同源，有研究報道指出木薯中MeUGT85K4及MeUGT85K5基因和氰苷的合成密切相關[20]。目前沒有發現其他課題組對MeUGT41基因在木薯中的抗病功能進行研究。本研究顯示Xam病菌處理會誘導MeUGT41基因的表達上升，抑制MeUGT41基因的表達量會降低木薯葉片對Xam病菌的抵抗力。雖然MeUGT41基因表達量被抑制的程度和細菌數量之間沒有明顯的一一對應關系，但也能證明MeUGT41基因在木薯葉片抵抗Xam病菌侵染的過程中發揮了作用。而基因表達量和細菌數量之間的無對應現象，推測可能是因為葉片不同位置的MeUGT41基因被抑制的程度不同而導致。對MeUGT41、UGT76B1以及UGT74F1基因的蛋白質序列進行比對分析，結果顯示它們之間有較近的進化關系，推測MeUGT41基因可能是通過影響水楊酸和茉莉酸的合成來響應Xam病菌侵染。綜上所述，MeUGT41基因表達和木薯抵抗細菌性枯萎病的能力密切相關，這些結果為研究MeUGT41基因抵抗木薯細菌性枯萎病的機制提供了理論基礎，也為進一步研究木薯的抗生物脅迫機制提供了一定參考。