沙棘hrh-miR319e靶向轉錄因子AP4調控種子發(fā)育的研究

于 淼，阮成江*，丁 健，李景濱，盧順光，溫秀鳳

(1 大連民族大學 資源植物研究所，遼寧大連 116600；2 水利部沙棘開發(fā)管理中心，北京 100038)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)落葉多年生灌木或小喬木，主要分布在亞歐大陸的溫帶地區(qū)[1]。沙棘生長快速、耐旱、耐鹽堿、抗風沙，是水土保持和防沙治沙的重要生態(tài)木本糧油樹種[2-3]。沙棘種子油富含生物活性物質(ω-3和ω-6脂肪酸等)，具有較高的藥用、營養(yǎng)和保健價值[1]。種子大小是重要的產量構成因素，但沙棘籽粒小(千粒重為7.14～18.95 g)[4]，種子畝產僅20～40 kg[1]。因而，深入研究沙棘種子發(fā)育機理，可為其產量提高奠定理論基礎。

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的單鏈小RNA，通過堿基互補配對的方式識別靶基因，轉錄后水平上抑制靶基因表達或剪切靶基因，在植物細胞分化、生長發(fā)育、非生物及生物脅迫響應過程中起著重要的調控作用[5-10]。過表達OsmiR397的水稻圓錐花序分枝增生、谷粒增大、產量增高[11]。miR319是植物中一個較為保守的miRNA家族，能夠通過調節(jié)靶基因TCPs和MYB等轉錄因子家族基因表達，進而調控葉和花的形態(tài)建成、生長發(fā)育和衰老[12-13]。水稻miR319通過靶向OsTCP21和OsGAmyb負調控水稻分蘗數(shù)和籽粒產量[14]，白菜miR319靶向TCPs參與細胞分裂從而調控葉片大小以及葉片邊緣的形態(tài)建成[15]；棉花miR319通過靶向GhTCP4促進棉花纖維從細胞伸長向壁增厚的轉變[16]。Schommer等[17]的研究表明，miR319靶向TCP轉錄因子負調控葉發(fā)育進程，但正調控葉衰老進程。miR319家族在擬南芥中有3個成員(miR319a、miR319b和miR319c)，miR319a-TCP4在雄蕊和花瓣發(fā)育中起關鍵作用，而miR319c則在葉生長發(fā)育過程中起關鍵調控作用[18]。Schommer等[19]的進一步研究表明，miR319b靶向的TCP4通過下游細胞周期靶基因ICK1/KRP1調控細胞增殖。到目前為止，對miR319調控植物生長發(fā)育的研究主要集中在葉和花器官上，其在植物種子中表達分析的研究較少。

AP4 (activator protein 4)作為bHLH轉錄因子家族的一員，通過識別和結合E-box(CANNTG)序列調控靶基因表達，廣泛參與細胞增殖與分化、細胞周期、細胞凋亡等基本生物學進程[20-22]。Gershlick等[23]的研究表明，煙草液泡分選受體(vacuolar sorting receptor, VSR)的高爾基體運輸受COPII(coat protein complex II)、AP1和AP4蛋白復合體調控。Fuji等[24]的研究表明，擬南芥AP4復合物通過識別VSR1調控液泡蛋白分選，液泡分選突變體gfs4、gfs5和gfs6種子積累高水平的VSR1分別響應于AP4亞基AP4b、AP4m和AP4s的編碼基因，其中位于反面高爾基體結構域的AP4m主要結合VSR1的酪氨酸元件(tyrosine-based motif)。到目前為止，未見研究轉錄因子AP4在植物生長發(fā)育過程中的表達變化。

本研究基于前期沙棘不同發(fā)育期種子miRNA-seq和mRNA-seq聯(lián)合分析中發(fā)現(xiàn)沙棘hrh-miR319e靶向轉錄因子AP4，利用RNAhybrid軟件預測miR319e靶向結合候選靶基因AP4的3′-UTR區(qū)的結合位點；構建pcDNA3.1+pmirGLO-AP4和pcDNA3.1-hrh-mir319e+pmirGLO-AP4質粒載體，利用雙熒光素酶報告基因檢測技術，驗證hrh-miR319e與候選靶基因AP4間的靶向關系；利用qRT-PCR方法分析沙棘種子發(fā)育過程中hrh-miR319e與AP4基因的表達變化。這不僅首次驗證了沙棘種子hrh-miR319e靶向轉錄因子AP4，而且hrh-miR319e-AP4模塊間的負調控關系為研究hrh-miR319e通過介導轉錄因子AP4調控沙棘種子發(fā)育的分子機制奠定了科學基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料為黑龍江省農業(yè)科學院鄉(xiāng)村振興科技研究所緩棱沙棘基地的3個沙棘品種‘新俄3號’、‘綏棘1號’和‘雜56’。2020年分別采收4個不同發(fā)育期(花后54、65、80和90 d)的果實。采集時選取2～4株該品種無性繁殖個體的不同方位果實，即上、中、下枝條與內、外部結果枝的果實(每個方位30～50個果實)。采后混勻的果實用液氮冷凍, 運送到大連民族大學資源植物研究所實驗室，并保存于-80 ℃冰箱備用。記錄觀測果實和種子形態(tài)特征，游標卡尺測定種子縱徑和橫徑(每個品種每個時期重復次數(shù)為8次)，電子天平測種子百粒重(重復次數(shù)為3)。

1.2 方 法

1.2.1 hrh-miR319e靶轉錄因子AP4結合位點預測基于獲得的沙棘hrh-miR319e成熟體序列和轉錄因子AP4序列，利用RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)軟件預測沙棘hrh-miR319e成熟體序列與候選靶基因AP4在其3′-UTR區(qū)的結合位點，并將沙棘hrh-miR319e與其他已報道植物miR319成熟體序列進行比對分析；利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)將沙棘AP4基因與已報道的其他植物AP4序列進行比對分析。

1.2.2 雙熒光素酶檢測1)基因合成及載體構建 合成hrh-miR319e前體序列(76 bp)，并在序列兩端添加EcoRⅠ、XhoⅠ 酶切位點，構建到pcDNA3.1表達載體(含amp抗性基因)，獲得pcDNA3.1-hrh-mir319質粒；合成AP4基因(3 340 bp)，并在序列兩端添加NheⅠ、SalⅠ酶切位點，構建到雙熒光素酶載體pmirGLO (含amp抗性基因), 獲得pmirGLO-AP4質粒；轉化質粒的TOP10感受態(tài)細胞轉移到含有氨芐霉素的LB (Luria-Bertani) 培養(yǎng)基上，隨機挑取若干菌落，進行菌落PCR驗證后，對陽性克隆進行測序驗證。pmirGLO載體含螢火蟲熒光素酶(Firefly luciferase)和海腎螢光素酶(Renilla luciferase)，海腎螢光素酶作為對照。

2) 質粒轉染 于轉染前一天在24孔培養(yǎng)板中接種293T細胞，使轉染時細胞密度在70%～80%，培養(yǎng)基為DMEM + 10% FBS；1 μL lipo2000轉染試劑及質粒稀釋到25 μL培養(yǎng)基中(總質粒量0.2 μg)，混合室溫孵育20 min；吸除皿中培養(yǎng)基，加入如上制備的轉染復合物(質粒+lipo2000+培養(yǎng)基) 200 μL，37 ℃培養(yǎng)5 h；吸除培養(yǎng)基，換0.5 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，轉染做5次重復，得到轉染質粒組合pcDNA3.1+pmirGLO-AP4和pcDNA3.1-hrh-mir319e+pmirGLO-AP4。

1.2.3 雙熒光素酶活性測定每孔中加入細胞裂解液200 μL，室溫孵育10 min后收裂解液，10 000 r/min離心5 min，取上清作為待測液；取100 μL待測液及100 μL螢火蟲熒光素酶檢測工作液加入96孔發(fā)光板中，吹吸混勻檢測發(fā)光值；再加入海腎熒光素酶檢測工作液100 μL，吹吸混勻檢測發(fā)光值，計算螢火蟲熒光素酶與海腎螢光素酶的比值(n=3)，作圖軟件為SigmaPlot12.5，各組數(shù)據(jù)的顯著性差異用應用One-Way方差分析(ANOVA)進行檢驗。

1.2.4 hrh-miR319e和AP4表達的qRT-PCR分析改進上海生工公司柱式植物總RNA抽提純化試劑盒的方法，提取3個沙棘品種不同發(fā)育期種子的總RNA；第一鏈cDNA的合成依據(jù)大連寶生物公司Mix-X miRNA First-Stand Symthesis Kit試劑盒的方法進行。qRT-PCR分析所需的特異引物(表1)由Primer Premier 5軟件設計，其中UBQ5是AP4表達水平分析的內參基因，U6是hrh-miR319e表達水平分析的內參；qRT-PCR實驗程序結合大連寶生物公司Mir-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit試劑盒和美國Applied Biosystems公司ABI-7500 RT-PCR儀推薦方法進行。目的基因或miRNA的相對表達量應用2-ΔΔCt方法進行分析[25]，實驗設3次重復。PCR反應體系的總體積為25 μL：12.5 μL TB Green Advantage Premix(2X)，2 μL cDNA，0.5 μL ROX Dye(50X)，0.5 μL正、反向引物(10 μmol/L)和9 μL RNase Free ddH2O。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s；40個循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s；溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。

表1 熒光定量qRT-PCR引物

1.3 數(shù)據(jù)分析

單因素方差分析和LSD法差異性檢驗(P<0.05)應用SPSS 26.0軟件完成，作圖采用Origin 8.5完成。

2 結果與分析

2.1 沙棘不同發(fā)育期果實及種子特征

隨著果實的增大，沙棘‘新俄3號’、‘綏棘1號’和‘雜56’的果皮顏色變化顯示為綠色(果實外皮密布白色鱗狀毛, 硬度高)、綠橙色(果實外皮鱗狀毛逐漸變疏, 葉綠素逐漸降解)、橙黃色(果實外皮鱗狀毛消失, 色素大量合成)和橙紅色(果實逐漸成熟穩(wěn)定，生長速率減緩)，種子顏色由綠色轉為橙黃色，再轉為黑褐色(圖1，A)；沙棘種子橫徑、縱徑及百粒重在花后80 d前呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(圖1，B-D)，并均在花后80 d達到最大值，其中‘雜56’橫徑最大(3.68 mm)，‘新俄3號’縱徑(9.52 mm)及百粒重最大(4.86 g)，花后80到90 d種子因失水變小，增長速度減緩趨平，或呈現(xiàn)不明顯的下降趨勢。

2.2 hrh-miR319e靶向AP4位點預測

沙棘hrh-miR319e成熟體序列為UUUGGACUGAAGGGAGCUCCU，因其注釋信息來源于葡萄的miR319e，所以被命名為hrh-miR319e，其成熟體序列與葡萄(Vitisvinifera)和無油樟(Amborellatrichopoda)的完全相同(圖2，A)。擬南芥中未發(fā)現(xiàn)miR319e，但沙棘hrh-miR319e與擬南芥中4個miR319成員的成熟體序列高度相似(圖2，B)，僅存在單個堿基差別。

沙棘AP4基因序列與其他植物間進行多重比對的結果表明，AP4在不同物種間高度保守(圖3)。RNAhybrid軟件預測發(fā)現(xiàn)，沙棘hrh-miR319e成熟體序列與候選靶基因AP4的3′-UTR區(qū)的第5 410～5 430位點完全互補(圖4)，顯示沙棘AP4可能是hrh-miR319e的潛在靶基因。

2.3 雙熒光素酶報告基因檢測驗證hrh-miR319e-AP4靶向關系

pcDNA3.1+pmirGLO-AP4和pcDNA3.1-hrh-mir319e+pmirGLO-AP4質粒的酶切PCR產物與目的序列比對一致(圖5)，表明雙熒光素酶報告載體構建成功。質粒pcDNA3.1+pmirGLO-AP4和pcDNA3.1-hrh-mir319e+pmirGLO-AP4熒光值分別為(1.19±0.03)和(0.95±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖6)。pcDNA3.1-hrh-mir319+pmirGLO-AP4組顯著地抑制了熒光素酶的活性，與pcDNA3.1+pmirGLO-AP4組相比，熒光素酶活性極顯著下調20.4%。因此，沙棘hrh-miR319e靶向AP4基因，且抑制其表達。

2.4 不同時期種子hrh-miR319e和AP4表達的qRT-PCR分析

3個沙棘品種不同發(fā)育期種子總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶清晰，28S和18S條帶明顯，且5S可見，OD260/280比值在1.9～2.1之間，總RNA純度和完整性良好(圖7，A)。‘綏棘1號’的AP4基因、hrh-miR319e以及2個內參(UBQ5和U6)PCR產物的2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測的片段大小在100～200 bp之間，條帶清晰且與設計大小吻合(圖7，B)，各特異引物擴增結果經溶解曲線驗證表明，無引物二聚體(圖7，C)。

qRT-PCR分析表明，沙棘hrh-miR319e在‘新俄3號’、‘綏棘1號’和‘雜56’種子發(fā)育期均呈先上升后下降趨勢(圖8，A)。花后54～80 d，種子hrh-miR319e的表達量持續(xù)上升，并在花后80 d達到最高值，hrh-miR319e在‘新俄3號’種子中的相對表達量為3.146，在‘綏棘1號’中為4.298，在‘雜56’中為3.892；花后80～90 d間則呈下調表達模式，但其表達量高于花后54 d的最低值。3個沙棘品種的種子AP4表達量在花后80 d之前持續(xù)下調，且表達量在花后80 d達到最低值，AP4在‘新俄3號’中的相對表達量為0.427，在‘綏棘1號’中為0.526，在‘雜56’中為0.451；花后80～90 d間呈上調表達模式，但明顯低于花后54和65 d的表達量(圖8，B)。對比分析hrh-miR319e和AP4的表達量表明，沙棘hrh-miR319e負調控其靶基因AP4，當hrh-miR319e的表達量達到最高水平時，AP4的表達量為不同發(fā)育期種子的最低值。

3 討 論

種子是糧油的最主要來源，面對持續(xù)增長的糧油需求，對種子發(fā)育機理的深入研究將有助于糧油植物產量和品質的提高[26]。本研究首次確證了沙棘種子hrh-miR319e靶向轉錄因子AP4，二者在沙棘不同發(fā)育期種子中的表達量存在顯著差異，且存在負調控關系。這為研究hrh-miR319e-AP4模塊調控沙棘種子發(fā)育的作用機制提供了科學參考。

miR319通過靶向TCPs和MYB等轉錄因子家族基因來調控其下游靶基因表達，影響植物生長發(fā)育[17]，例如，蒺藜苜蓿miR319a通過調節(jié)TCP3/4/10a/10b的表達水平，從而調控結節(jié)數(shù)量[27]；柑橘miR319通過下調MYB表達，減少根尖數(shù)量，使根系結構在硼毒脅迫下規(guī)律生長[28]。但到目前為止，未見miR319e靶向轉錄因子在種子發(fā)育過程中起調控作用的報道。本研究首次表明hrh-miR319e通過靶向轉錄因子AP4在種子發(fā)育過程中起著重要的調控作用。一方面，沙棘hrh-miR319e可能通過調控下游靶基因影響種子發(fā)育。沙棘種子發(fā)育過程中，hrh-miR319e的表達量存在顯著差異，這與miR319在麻風樹[29]、窄葉羽扇豆[30]、花生[31]和玉米[32]的不同發(fā)育期種子中存在明顯的表達差異相一致。另一方面，AP4基因在沙棘種子發(fā)育過程中起著重要的調控作用。本研究表明，沙棘不同發(fā)育期種子中的AP4表達量存在明顯差異，種子發(fā)育早期，正處于細胞增殖與分化旺盛期，AP4表達量較高；隨后種子發(fā)育減緩，AP4表達量不斷降低；而當種子進入成熟期時，AP4表達量略有上升，可能與營養(yǎng)物質的貯存、積累及消耗有關。這與AP4廣泛調控細胞增殖與分化、細胞周期、細胞凋亡等進程[22-24]的研究結果相一致。在華南忍冬中，與對照相比，轉AP4植株具有更短的生長遲滯期和較高的生物量，轉AP4基因的擬南芥耐鈣性顯著增強，且可維持細胞內正常水平的葉綠素含量、可溶性蛋白、可溶性糖含量以及較高水平的CAT活性，從而使細胞維持較高的細胞質濃度和清除細胞內多余的活性氧[33]。

沙棘hrh-miR319e通過介導靶基因AP4表達的種子發(fā)育調控，不僅為miR319在種子發(fā)育過程中起重要調控作用提供了直接證據(jù)，而且可為研究重要轉錄因子AP4的生物學功能奠定理論基礎，對深層次闡明種子發(fā)育機理及未來油料作物遺傳改良均具有重要意義。