松葉豬毛菜NADP-蘋果酸酶基因家族及啟動子克隆分析

張玉慧，王玉蘭，夏春蘭，聞志彬*

(1 中國科學院新疆生態與地理研究所，荒漠與綠洲生態國家重點實驗室，烏魯木齊 830011; 2 中國科學院新疆生態與地理研究所標本館，烏魯木齊 830011; 3 中國科學院大學，北京 100049)

NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)是C4植物的關鍵光合酶，參與生物體內L-蘋果酸代謝。在Mg2+或Mn2+存在的情況下，催化蘋果酸發生氧化脫羧反應生成丙酮酸、CO2和NADPH[1]。NADP-ME由一個小的基因家族編碼，一般包括3～5個基因[2-9]。大多數植物NADP-ME序列都比較保守，其氨基酸序列含有5個保守區域，即保守區域Ⅰ(VYTPTVGEACQK-YG)、Ⅱ(IQVIVVTDGERILGLGDLGCQGMGIPV-GKL)、Ⅲ(QFEDFANHNAF)、Ⅳ(FNDDIQGTASVVL)和Ⅴ(LFLGAGEAGTGIAEL)[10]。在植物中根據NADP-ME行使的功能不同，可將其分為光合型NADP-ME和非光合型NADP-ME。光合型NADP-ME定位在C4植物維管束鞘細胞的葉綠體和景天酸代謝(CAM)植物的細胞質中，為光合反應中CO2的固定提供CO2[10]；非光合型的NADP-ME位于C3、C4和CAM植物葉綠體或細胞質中[1]，與植物的許多生理功能有著密切的關系，如防御應答、脂肪酸生物合成以及pH調節等[11-14]。

NADP-ME家族在不同植物中的組織表達模式存在差異。擬南芥含有4個NADP-MEs，其中NADP-ME1(AT1)在根中表達量較高，NADP-ME2(AT2)和NADP-ME4(AT4)在根、莖、葉和花中都有表達，NADP-ME3(AT3)在花中表達量較高[2]。玉米包含5個NADP-MEs，其中Zmcyt3-NADP-ME、ZmC4-NADP-ME和ZmnonC4-NADP-ME在不同器官表達模式具有差異。Zmcyt3-NADP-ME主要在莖中表達，ZmC4-NADP-ME在葉鞘和葉片中表達量較高，ZmnonC4-NADP-ME在穗中表達量較高；Zmcyt1-NADP-ME和Zmcyt2-NADP-ME在葉、莖、根、葉鞘、未成熟和成熟的穗以及授粉14 d籽粒中都有表達[3]。小麥含有2個NADP-MEs(TaNADP-ME1和TaNADP-ME2)，它們在根、莖和葉中均表達，且TaNADP-ME1在葉中表達量較高[4]。水稻包含4個NADP-MEs，其中OschlME、OscytME1和OscytME3在水稻根、葉和穗上都有表達，而OscytME2在根中表達量較高[8]。

不同植物NADP-ME家族成員在應對非生物脅迫中存在差異。對谷子7個NADP-MEs進行ABA、低溫和鹽脅迫后，SiNADP-ME1和SiNADP-ME6的相對表達量變化最大，SiNADP-ME1在上述脅迫下的相對表達量分別為對照的460.53、411.50和15.24倍；SiNADP-ME6的相對表達量分別為對照的211.13、15.21和643.99倍，而其他基因的表達量上調范圍均在對照的5倍以內[15]。對玉米5個NADP-MEs進行ABA脅迫，發現ABA誘導Zmcyt3-NADP-ME表達，ABA處理下其在根中表達量約是對照的90倍，其他基因除Zmcyt3-NADP-ME下調表達外，上調表達均在對照的4倍以內[3]。

啟動子是轉錄水平調控的重要元件，而轉錄水平調節是基因表達調控的重要環節[16]。啟動子中包含多種重要的順式作用元件，在轉錄水平上參與調控相應基因表達以及提高植物的抗逆性。因此研究啟動子的結構和功能對于基因表達調控機制的研究具有重要意義[17-19]。目前有關NADP-ME啟動子的研究較少，僅見在C3和C4植物，且研究集中在啟動子克隆、元件預測分析及表達特性等方面[15, 20-24]。Walter等[20]分離得到編碼菜豆NADP-ME(PvME1)啟動子區域ATG上游2 664 bp，并預測了該區域2個與紫外光和真菌響應有關的順式作用元件。李秀峰[22]克隆得到了水稻胞質型OscytME2的啟動子1 652 bp，連接GUS載體轉化擬南芥后發現GUS基因在植物生長不同時期表達部位不同，主要表達于主葉脈中。陳莉敏[23]克隆得到水稻OscytME3啟動子1 777 bp，具有較低的活性，其表達可能受多種逆境環境因子誘導。趙晉鋒等[15]利用PlantCARE在線軟件對谷子7個NADP-ME(SiNADP-ME)成員啟動子順式元件進行分析，發現SiNADP-ME成員啟動子區域主要包括激素類應答元件、逆境應答元件、光應答元件以及其他類生長調控相關順式元件，其中細胞周期調控元件MSA-like只存在于SiNADP-ME1啟動子中，晝夜節律元件circadian只存在于SiNADP-ME3啟動子中，根特異性motif I只存在于SiNADP-ME6啟動子中。

松葉豬毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)隸屬于藜科豬毛菜族[25]，主要分布于蒙古、哈薩克斯坦、吉爾吉斯斯坦和中國(新疆北部、內蒙古、寧夏和甘肅)[26-27]。松葉豬毛菜是典型的C3-C4中間型植物[28-30]，具有區別于C3和C4植物的光合結構和生理特征[31]。為了解中間型植物NADP-ME家族成員及其啟動子的結構和功能，本研究以松葉豬毛菜為研究對象，在鑒定克隆獲得NADP-ME家族基因序列的基礎上，基于熒光定量PCR(RT-qPCR)分析非生物脅迫下該家族成員的表達特征，并克隆NADP-MEs的啟動子序列，對其順式元件進行生物信息學分析和預測。通過本研究初步認識松葉豬毛菜NADP-ME家族成員及其啟動子的結構和功能，為進一步研究該中間型植物NADP-ME的功能和進化奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

松葉豬毛菜(SalsolalaricifoliaTurcz. ex Litv.)種子采自新疆博樂，取適量種子經消毒后置于1/2MS固體培養基，在人工氣候箱中進行萌發(萌發條件：白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照強度2 200 Lx)，待萌發后轉移至霍格蘭營養液進行培養(培養條件白天25 ℃、14 h；夜晚18 ℃、10 h；光照強度6 000 Lx)。培養1周后，將光照強度升高至24 000 Lx，其他條件不變，取30 d苗齡的葉片保存在-80 ℃冰箱中以備后續提取DNA。

1.2 方 法

1.2.1 松葉豬毛菜基因組DNA的提取采用天根的植物基因組DNA提取試劑盒提取30 d松葉豬毛菜葉片的DNA，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳及核酸蛋白定量儀Nanodrop 2000檢測顯示DNA的濃度和質量。

1.2.2 松葉豬毛菜NADP-ME基因家族的克隆根據前期實驗組測得的松葉豬毛菜根、莖和葉混合的轉錄組數據，收集注釋為NADP malic enzyme的所有unigene，共發現了6條unigene，其中2條為污染序列，將其剔除；2條unigene序列完全一致，實為一條轉錄本。在NCBI數據庫中比對確定3條序列，均包含完整的ORF。根據序列利用DNAMAN 7設計引物(表1)，并以松葉豬毛菜基因組為模板，克隆得到松葉豬毛菜NADP-ME基因家族成員序列。

1.2.3NADP-ME家族基因生物信息學分析在Tair數據庫(https://www.arabidopsis.org)下載擬南芥NADP-ME基因家族AT1(AT2G19900.1)、AT2(AT5G11670.1)、AT3(AT5G25880.1)和AT4(AT1G79750.1)序列，并利用DNAMAN 7軟件對松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族進行多重序列比對。

1.2.4 組織表達及脅迫表達分析松葉豬毛菜正常條件下培養30 d，一部分材料收集根、莖和葉用于基因表達組織部位分析；另一部分幼苗進行ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000脅迫，將幼苗用不同濃度的ABA(0、50、100、150和200 mmol/L)、NaCl((0、50、100、150和200 mmol/L)、NaHCO3(0、15、30、45和60 mmol/L)和PEG6000(0%、10%、20%、30%、40%、50%和60%)進行脅迫處理，4 h后收集葉和根部，將未處理樣品設為對照組；液氮速凍，-80 ℃備用。

提取松葉豬毛菜總RNA，根據已克隆的NADP-ME序列設計引物，反轉錄后利用qRT-PCR技術對松葉豬毛菜3個NADP-MEs在植物組織中及在非生物脅迫下的表達特性進行分析。根據Zhang等[32]研究，選擇β-actin作為組織表達特性及正常情況下的內參，GAPDH和TUB分別作為ABA和NaHCO3脅迫下的內參基因，EF1a作為NaCl和PEG6000脅迫下的內參基因(表1)。qRT-PCR反應程序為： 94 ℃預變性5 min；34個循環，包括95 ℃變性30 s，58 ℃復性30 s， 72 ℃延伸20 s； 72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.5 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動子克隆及生物信息學分析利用mhiTAIL-PCR[33]和Genome Walking Kit方法克隆松葉豬毛菜NADP-ME家族成員的啟動子序列。根據已知編碼區序列，分別設計3條巢式PCR特異性引物(表2)，以松葉豬毛菜基因組DNA為模板進行DNA步移。將獲得的特異性產物與pMD18-T連接，并轉化大腸桿菌，菌液PCR鑒定陽性轉化子后送測。根據測序結果設計上下游引物(表2)，并從基因組DNA中擴增，經電泳檢測到清晰條帶，將目標片段切膠回收進行TA克隆，測序獲得最終啟動子序列。

表2 引物名稱及序列

利用BDGP(https://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)中Neural Network Promoter Prediction在線工具對SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的轉錄起始位點進行預測。利用在線軟件PLACE(https://www. dna.affrc.go.jp/PLACE)和Plant Care(http:// bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html)對啟動子序列上順式作用元件的種類、數量和功能進行預測分析。

1.2.6 數據分析運用Excel 2019分析處理數據，所有處理進行3次生物學重復，2次技術重復。用2-ΔΔCt方法處理數據，利用GraphPad Prism 8作圖。

2 結果與分析

2.1 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因的克隆

根據unigene基因序列設計引物，以松葉豬毛菜的cDNA為模板，進行RT-PCR克隆，得到3個NADP-MEs的基因序列。利用DNAMAN 7軟件對松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族成員進行多重序列比對，根據其與擬南芥NADP-ME序列的相似性高低，將這3個基因序列命名為SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4，它們CDS序列長度分別為1 755、1 758和1 941 bp(圖1)。

2.2 NADP-ME家族基因生物信息學分析

利用DNAMAN 7軟件對松葉豬毛菜和擬南芥NADP-ME基因家族進行多重序列比對，結果(圖2)發現松葉豬毛菜NADP-ME基因家族非常保守，都含有5個保守區域，除了在保守區Ⅰ-Ⅲ有個別堿基不同外，保守區Ⅳ-Ⅴ序列一致。

2.3 松葉豬毛菜NADP-ME家族成員的表達分析

2.3.1 組織表達特異性分析對松葉豬毛菜3個NADP-MEs在組織中的表達情況進行分析，將它們在莖中的表達量設為1.0。結果表明SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在根、莖和葉中都有表達，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 表達量表現為葉>莖>根，而SaNADP-ME1表達量表現為根>莖>葉(圖3)。

2.3.2 非生物脅迫下NADP-ME家族成員松葉豬毛菜幼苗中的表達分析由于SaNADP-ME1主要在根中表達，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4主要在葉中表達，因此對非生物脅迫下SaNADP-ME1在根中以及SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中的表達進行深入研究。在ABA脅迫處理下，SaNADP-ME1在根中的表達量明顯下降，并在ABA質量濃度為200 mmol/L時達到最低 (將對照組基因的表達量作為參照，設為1.00，下同)；SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中的表達量隨著ABA質量濃度的增加而上升，且在ABA質量濃度為200 mmol/L時表達量達到最高(圖4，A和圖5，A)。在鹽脅迫下，SaNADP-ME1和SaNADP-ME2表達量變化均不明顯，SaNADP-ME4表達量隨著鹽質量濃度的增加呈現出先增加后減小的趨勢，在100 mmol/L處理下達到最高(圖4，A和圖5，B)。在NaHCO3脅迫下，隨著質量濃度的增加，SaNADP-ME1呈現先下降后上升的趨勢，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4表達量沒有明顯變化(圖4，B和圖5，C)。在PEG6000脅迫下，SaNADP-ME1在50%PEG600表達量明顯較低，SaNADP-ME2和SaNADP-ME4 在40%PEG6000時表達量最高，在其余體積濃度百分比表達量變化均不明顯(圖4，C和圖5，D)。結果表明，在ABA、NaCl、NAHCO3和PEG6000脅迫下松葉豬毛菜3個NADP-MEs均可被誘導表達，且SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的表達模式相似。

2.4 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動子的克隆

為了克隆SaNADP-ME1啟動子區域，利用Genome Walking Kit進行了3次DNA步移，獲得3段特異性產物，長度分別為757、967和1 263 bp；利用mhiTAIL-PCR方法和Genome Walking Kit各進行了1次DNA步移，共克隆得到SaNADP-ME2啟動子的2段特異性產物，長度分別為846 和589 bp；利用mhiTAIL-PCR和Genome Walking Kit方法克隆SaNADP-ME4啟動子區域，共進行2次DNA步移，獲得2段特異性產物，長度分別為1 450和2 203 bp。利用DNAMAN軟件將多次步移獲得的啟動子片段拼接成完整序列，根據序列兩端分別設計上下游引物(表3)，并從基因組DNA中擴增。經電泳檢測后測序，結果表明克隆得到SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4的啟動子區域序列長度分別為2 351、1 655和2 887 bp(圖6)。

2.5 NADP-ME基因家族啟動子生物信息學分析

利用BDGP對松葉豬毛菜NADP-ME基因家族啟動子進行轉錄起始位點預測，結果分析表明它們轉錄起始位點大約位于150～250 bp之間。SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4轉錄起始位點分別位于翻譯起始位點(ATG)上游164 bp處(為堿基A)、162 bp處(為堿基C)和207 bp處(為堿基A)。

利用PLACE和Plant Care對啟動子區域進行順式作用元件分析(表3)，結果表明這3個NADP-MEs啟動子區域都普遍存在組織和器官特異性表達元件、光響應元件及激素響應元件，其中與組織或器官特異性表達相關的元件有葉肉特異性元件CAC-TFTPPCA1和根特異性元件ROOTMOTIF-TAPOX1等；參與調控光合基因表達的順式作用元件有G-box、Box4、ACE、ATC-motif、GT1CONSENSUS和EBOXBNNAPA等，其中ATC-motif僅在SaNADP-ME1啟動子序列中發現，ACE和GT1-motif元件僅在SaNADP-ME4啟動子序列中發現；參與激素響應的元件有水楊酸誘導元件、脫落酸誘導元件、生長素誘導元件和茉莉酸甲酯誘導元件等，其中生長素誘導元件TGA-element僅在SaNADP-ME4中存在。此外，在3個基因啟動子區域還發現干旱誘導相關元件和厭氧誘導元件等，其中參與干旱誘導的MYB結合位點MBS僅在SaNADP-ME4中存在。

表3 松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動子區域順式作用元件分析

3 討 論

NADP-蘋果酸酶(NADP-ME)是C4植物光合作用中的關鍵酶，在生物和非生物脅迫中發揮了重要的作用。本研究以C3-C4中間型植物松葉豬毛菜為研究材料，克隆得到其3個NADP-MEs(SaNADP-ME1、SaNADP-ME2和SaNADP-ME4)及啟動子序列。NADP-ME家族在不同植物中組織表達模式存在差異，如小麥、水稻、玉米和擬南芥等[2-5]，本研究發現松葉豬毛菜這3個NADP-MEs組織表達模式也存在差異。雖然他們在根、莖和葉都有表達，但SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中表達量最高，SaNADP-ME1在根中表達量最高。

Fu等[4]發現外源激素ABA可以調節小麥中TaNADP-ME1和TaNADP-ME2的表達。Liu等[34]發現在NaHCO3、NaCl和PEG6000的存在下，水稻幼苗葉和根中的NADP-ME活性增加50%以上。這些表明ABA、NaHCO3、NaCl和PEG6000均可以誘導NADP-ME的表達。本研究發現在4種非生物脅迫(ABA、NaCl、NaHCO3和PEG6000)下，松葉豬毛菜幼苗中這3個NADP-MEs均可被誘導表達，其中SaNADP-ME2和SaNADP-ME4在葉中響應非生物脅迫的表達模式相似，對干旱響應最為明顯，在干旱脅迫下最大表達量約為對照組的3倍，SaNADP-ME1在根中對ABA和NaHCO3的響應更加明顯，在ABA脅迫和NaHCO3下最小表達量為對照組的0.5倍，推測松葉豬毛菜NADP-ME基因家族可能在響應ABA、鹽脅迫、滲透壓和干旱脅迫中發揮了重要作用。

松葉豬毛菜NADP-ME家族基因啟動子順式作用元件預測結果顯示，其啟動子區域含有各種激素響應元件、生物和非生物響應元件，以及一些組織或器官特異性元件。與松葉豬毛菜其他2個NADP-MEs相比，SaNADP-ME4中還存在光反應順式作用元件ACE、GT1-motif元件、生長素誘導元件TGA-element以及參與干旱誘導的MYB結合位點MBS。qPCR結果表明在PEG6000脅迫下，SaNADP-ME4在葉中的表達量有明顯變化，干旱誘導的MYB結合位點MBS可能在SaNADP-ME4響應干旱中發揮了重要作用。SaNADP-ME1在根中表達量最高，且ABA脅迫處理下，SaNADP-ME1在根中的表達量下降，并在ABA質量濃度為200 mmol/L時達到最低。Arias等[35]推測AT1在ABA信號響應中發揮著特殊的作用。通過生物信息學分析顯示SaNADP-ME1與AT1啟動子都含有脫落酸誘導元件ABRE，該元件可能在SaNADP-ME1響應ABA中發揮著重要作用。

本研究通過對松葉豬毛菜3種NADP-ME啟動子順式作用元件進行生物信息學分析和預測，初步認識NADP-ME啟動子的結構和功能，為后續研究NADP-ME家族基因奠定了基礎，也為深入研究C4植物光合基因的功能和進化提供了理論依據。