肉桂醛調控不結球白菜多胺氧化酶-過氧化氫系統緩解硒脅迫的機理研究

楊會敏，王 旭，郝旖旎，石志琦，陳 健，楊立飛*

(1 南京農業大學 園藝學院，南京 210095； 2 江蘇省農業科學院 農產品質量安全與營養研究所，南京210014；3 南京農業大學 和縣新農村發展研究院，安徽和縣 238200)

硒(selenium，Se) 是動植物生長發育所需的重要微量營養元素之一，它既有益又有害，這種雙重效應之間的界限非常狹窄，并且在物種之間有所不同[1]。鑒于硒對人體健康的重要性，人們開始越來越多地關注富硒農產品[2]。然而持續施用硒肥增加了農業生態系統中硒的釋放量，對作物生長造成潛在危害[3]。此外，灌溉、采礦、煉油、化石燃料燃燒和工業廢水排放等人類活動也造成了環境中硒污染程度增加[4]。因此，了解植物如何與過量硒反應的機制對于植物、人類和動物營養以及降低環境中硒污染的風險非常重要。

硒脅迫擾亂植物的生理狀態，進而阻礙植物的生長發育。活性氧(reactive oxygen species，ROS)過量累積誘導的氧化應激是植物響應逆境脅迫的重要作用方式[5-6]。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是ROS的典型代表之一[7]，其含量超過氧化還原反應和細胞信號傳導所需的正常生理水平時，會導致細胞損傷和細胞死亡[8]。植物細胞中，H2O2產生與多胺(polyamines，PAs)代謝密切相關。多胺主要包括腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)[9]。多胺氧化酶(polyamine oxidases，PAO)分解代謝Spd或Spm生成H2O2，是植物中H2O2的重要生物合成途徑[10]。當植物處于逆境條件下，PAO活性會顯著增加，以降低逆境誘導的細胞內高H2O2水平累積的PAs，導致ROS爆發，進而導致細胞死亡[11]。我們前期研究發現，硒脅迫能夠誘導不結球白菜體內PAO介導的H2O2累積，進而導致細胞損傷和生長受阻[12]。因此，PAO-H2O2系統可能是調控植物耐硒的作用靶點之一。

肉桂醛(cinnamaldehyde，CA)，是一種醛類有機化合物，是肉桂精油的主要成分。肉桂醛是一種環境友好型植物源天然化合物，具有抗氧化[13]、抗癌[14]、抑菌[15]等多種功能。但是肉桂醛在植物生理調節中的作用鮮有報道。本實驗室前期工作發現肉桂醛可以抑制疫霉菌生長、緩解植物重金屬鎘脅迫傷害[16-17]，這些發現啟示我們探究肉桂醛調控植物抗性生理抵御硒脅迫的可能性。

本研究以不結球白菜(Brassicarapa)幼苗根為材料，結合生理生化試驗手段，研究肉桂醛調控不結球白菜PAO-H2O2系統緩解硒脅迫作用方式，旨在為揭示植物源天然化合物肉桂醛緩解植物硒毒害的作用機制提供理論基礎，并為農業生態環境中硒肥的合理施用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料和試劑

供試不結球白菜(品種‘四月慢’)種子購自南京綠領種業有限公司。將種子用1% NaClO消毒10 min后，用單蒸水沖洗3遍，浸泡2 h后將其置于黑暗的塑料網上發芽。待根長1.5 cm時，挑選生長一致的幼苗，轉至1/4 Hoagland 營養液中培養，并在其中加入不同試劑進行處理。光照培養箱培養條件為：溫度(25±1) ℃、光周期16 h(晝)/8 h(夜)，相對濕度75%，光照強度200 μmol·m-2·s-1。供試藥劑肉桂醛購于國藥集團化學試劑有限公司，純度大于95%，用二甲基亞砜(DMSO)溶解并配制成母液，密封保存備用；其他常規化學試劑為分析純。

1.2 試驗設計

試驗1: 設置梯度濃度亞硒酸鈉(Na2SeO3)(0、 5、10、20、40和80 μmol·L-1)處理不結球白菜幼苗根，每個處理64株幼苗，3次重復。處理72 h后測定根長，篩選出能夠誘導抑制根長50%的硒處理濃度。

試驗2：在上述篩選出的硒濃度處理下，添加梯度濃度肉桂醛(0、10、50、100、200和300 μmol·L-1)處理不結球白菜幼苗根，每個處理64株幼苗，3次重復。處理72 h后，測定根長，篩選出能夠有效緩解硒脅迫的最佳肉桂醛濃度。

試驗3: 根據上述篩選出的硒濃度和肉桂醛濃度，設置以下4個處理：①對照(CK)；②Se處理；③Se+CA處理；④CA處理。每個處理64株幼苗，3次重復。處理72 h后取根，用單蒸水沖洗3次后，吸干表面水分，測定各項生理生化指標。

1.3 測定指標及其方法

1.3.1 生長指標取不同處理后的幼苗，用直尺測定根長 (每個處理選取30株長勢均一的幼苗，作為30次重復)，采用電子天平測量根鮮重(每個處理3次重復，每次重復選取10株長勢均一的幼苗)。

1.3.2 丙二醛(MDA)熒光染色將處理幼苗根尖用單蒸水漂洗干凈，置于10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min(25 ℃，避光)，然后用單蒸水沖洗 3 次，置于熒光顯微鏡下觀察紅色熒光并拍照，每個處理3次重復。采用 Image-Pro Plus 6.0分析計算MDA相對熒光密度。

1.3.3 MDA含量參照McCord等[18]的方法，取 0.1 g 根置于預冷的研缽中，研磨至勻漿，加入 1.6 mL 10%三氯乙酸(TCA)，4 000 r/min離心 10 min，所得上清液即為待測液。以 10% TCA 為對照，取 1.5 mL 上清液加入 1.5 mL 0.67%的硫代巴比妥酸，沸水浴30 min，迅速置于冰上冷卻，再次離心取上清液，分別在 450 、532 和 600 nm波長下測定吸光值A450、A532和A600。每個處理3次重復，根據以下公式計算丙二醛(MDA)含量。MDA(μmol/g)=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450] ×V/(1000×W)。式中，V和W分別為提取液體積和植物樣品重量。

1.3.4 細胞死亡檢測參照Kellermeier等[19]的方法，檢測方法同1.3.2，只是將10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min改為2 μmol·L-1的PI 溶液染色20 min。

1.3.5 H2O2熒光染色參照Yamamoto等[20]的方法，檢測方法同1.3.2，只是將10 μmol·L-1的 C11 BODIPY 581/591溶液中染色10 min改為5 μmol·L-1的BES-H2O2-Ac溶液染色15 min。

1.3.6 H2O2含量采用試劑盒(A064-1，南京建成生物工程研究所) 檢測H2O2含量。

1.3.7 PAO活性參照汪天等[21]的方法，反應體系包含1.5 mL磷酸緩沖液(0.1 mol·L-1，pH 6.5)，0.2 mL顯色液(100 mL磷酸緩沖液中含有4-氨基氨替吡啉(10 mg)和25 μL N, N-二甲基苯胺)，0.1 mL辣根過氧化物酶，0.2 mL酶提取物，最后加入0.1 mL底物Spd(20 mmol·L-1)或Spm(20 mmol·L-1)催化反應。每個處理3次重復，以每分鐘515 nm吸光值變化0.01為一個酶活單位。

1.3.8BrPAOs家族基因表達分析采用QIAGEN總RNA提取試劑盒提取根總RNA，采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TakaRa)用于合成cDNA的第一鏈。根據TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa)說明，利用ROCHE(LightCycler?480 Ⅱ)進行基因定量表達分析；基于2-ΔΔCt方法計算表達數據。以Actin的相對轉錄豐度作為內標。每個處理表達水平是對照的相對值。設計用于基因擴增的引物見表1。

1.4 數據統計分析

根據不同實驗設計，采用3～30次生物學重復的平均值±標準差(SD)對實驗結果進行單因素方差分析(One way ANOVA)，F檢驗分析不同處理之間的差異顯著性(P<0.05)。采用Excel軟件處理數據并作圖。針對每一個測定的生理參數，計算出處理后相較于對照的變化倍數(log2)，然后采用TBtools軟件中的HeatMap繪制聚類分析熱圖。對于同一種處理方式的不同生理參數，采用R語言程序下的corrplot程序包進行Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 硒對不結球白菜幼苗根系生長的影響

各濃度水平的硒均顯著抑制不結球白菜幼苗根系生長，并呈現濃度效應，其根長和根鮮重隨著硒濃度的增加而顯著下降(圖1)。其中，在5、10、20、40和80 μmol·L-1硒脅迫處理下，根長分別比對照顯著降低 24.5%、33.5%、50.2%、58.8% 和 71.8%(圖 1，A)，根鮮重分別比對照降低11.7%、34.4%、49.4%、62.3%和71.2%(圖 1，B)。20 μmol·L-1硒脅迫對幼苗根長和根鮮重具有顯著抑制作用，抑制率均約為50%。因此，選擇其用于后續試驗。

2.2 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗根系生長的影響

圖2顯示，各濃度肉桂醛均可以顯著緩解硒脅迫對不結球白菜幼苗根系生長的抑制作用，并且呈現濃度效應。其中，在10、50、100、200和300 μmol·L-1的肉桂醛處理下，幼苗根長分別比20 μmol·L-1硒處理增加9.1%、40.6%、25.0%、10.0%和3.1%(圖 2，A)；50 μmol·L-1的肉桂醛對硒脅迫造成的根系生長抑制具有顯著緩解作用且效果最佳，因此選擇50 μmol·L-1的肉桂醛(CA50)用于后續試驗。

同時，時間效應顯示，從處理6 ～72 h，4個處理幼苗根長均逐漸增加，但根長始終表現為CK>CA50>Se+CA50>Se處理，且處理間差異在各時期均達到顯著水平；在幼苗處理72 h后，3個處理的幼苗根長與CK相比均顯著降低，CA50處理比CK降低2.4%，而CA50處理比Se、Se+CA50處理分別顯著增加72.1%和21.2%，Se+CA50處理的幼苗根長又比Se處理顯著增加42.0%(圖 2，B、C)。

另外，各處理幼苗根鮮重的表現與根長相似，各處理幼苗根鮮重均顯著低于對照，CA50處理比CK降低15.4%； CA50處理比Se、Se+CA50處理分別顯著增加37.6%和19.5%，Se+CA50處理又比Se處理顯著增加15.1%(圖 2，D)。以上結果表明，外源添加肉桂醛能夠有效逆轉硒脅迫對不結球白菜幼苗造成的生長抑制。

2.3 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗氧化損傷的影響

不結球白菜幼苗根尖MDA熒光亮度在Se處理下明顯強于CK，添加CA50后其亮度有所減弱(圖3，A)。Se 處理對幼苗造成了氧化損傷，其根尖MDA熒光密度是CK的1.4倍；與Se處理相比，Se+CA50處理MDA熒光密度顯著降低24.7%；CA50處理MDA熒光密度與CK差異不顯著(圖 3，B)。同時，與CK相比，Se處理后幼苗根尖MDA含量漲幅達到1.3倍，而Se+CA50處理MDA含量比Se處理顯著降低46.3%；CA50處理MDA含量與CK、Se+CA50處理相比均差異不顯著(圖 3，C)。以上結果表明，肉桂醛能夠顯著減少硒脅迫導致的不結球白菜幼苗的氧化損傷。

2.4 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗細胞死亡的影響

與CK相比，Se 處理不結球白菜幼苗根尖熒光亮度較強，相對細胞死亡率高達CK的1.8倍；添加CA50后熒光亮度明顯減弱，相對細胞死亡率降低15.9%；CA50處理根尖相對細胞死亡率顯著低于Se和Se+CA50處理，降幅分別為59.6%和51.9%，但與CK差異不顯著(圖 4，A、B)。以上結果表明，肉桂醛能夠顯著減少硒脅迫導致的不結球白菜幼苗根尖細胞死亡。

2.5 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗H2O2含量的影響

Se處理不結球白菜幼苗根尖H2O2熒光亮度顯著高于CK，添加CA50后H2O2熒光亮度明顯減弱，但仍強于對照，表明硒脅迫對幼苗造成了H2O2累積，而CA50能明顯降低H2O2累積(圖5，A)。同時，通過計算可知，Se處理幼苗根尖H2O2熒光密度比CK漲幅達到1.3倍，添加CA50使H2O2熒光密度顯著降低27.0%，CA50處理H2O2熒光密度顯著低于Se和Se+CA50處理，分別降低了40.3%和18.2%(圖 5，B)。另外，通過測定H2O2含量可知，Se處理幼苗根尖H2O2含量比CK漲幅達到1.4倍，Se+CA50處理則使H2O2含量比Se處理顯著降低15.4%；同樣地，CA50處理的H2O2含量顯著低于Se和Se+CA50處理(圖 5，C)。可見，肉桂醛能夠顯著減少硒脅迫導致的不結球白菜幼苗體內H2O2累積。

2.6 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗PAO活性的影響

從圖6來看，以Spd、Spm為催化底物時，Se處理可以誘導不結球白菜幼苗根內PAO活性分別比相應CK顯著上升73.8%和16.9%；Se+CA50處理使根內PAO活性比Se處理分別顯著降低38.5%和21.3%，并與相應CK差異不顯著；CA50處理根內PAO活性與Se+CA50處理相比均無顯著差異(圖6)。另外，Se處理以Spd為催化底物的PAO活性均明顯高于相應的以Spm為催化底物的PAO活性。這表明硒脅迫可能主要通過誘導 PAO代謝Spd產生H2O2，肉桂醛則逆轉這一途徑。

2.7 肉桂醛對硒脅迫下不結球白菜幼苗6個BrPAOs家族基因表達量的影響

我們前期從不結球白菜基因組中鑒定出6個BrPAOs家族基因(BrPAO1-6)[12]。從圖7，C、E、F可知， Se處理可以顯著誘導不結球白菜幼苗BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表達水平上調，分別比CK顯著提高68.2%、57.7%和53.9%；而硒脅迫下加入CA50(Se+CA50處理)使BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表達水平下調，分別比Se處理顯著降低21.1%、61.3%和30.2%。同時，在Se處理下，不結球白菜幼苗BrPAO1和BrPAO4表達水平與CK差異不顯著，而BrPAO2表達水平卻比CK顯著下降11.6%；與Se處理相比，Se+CA50處理幼苗BrPAO1表達水平顯著降低，BrPAO4表達水平無顯著變化，BrPAO2表達水平卻顯著升高(圖 7，A、B、D)。以上結果表明，不結球白菜幼苗BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表達水平在Se處理和Se+CA50處理下分別顯著上調和下調，可能是導致最終PAO活性上升和下降的原因之一。

2.8 肉桂醛-硒處理后不結球白菜幼苗生理指標相關性分析

聚類熱圖常用于分析和可視化大規模數據[22-23]。將不同處理下測定的所有生理參數指標與各自對照相除并進行log2歸一化后，進行聚類分析。聚類結果(圖 8，A)顯示：不結球白菜幼苗根長和鮮重在Se處理后藍色加深，它們相比對照顯著下降；而在Se+CA50處理后藍色變淺，說明加入肉桂醛緩解了這兩個參數的下降趨勢。而不結球白菜幼苗其他傷害性參數指標(H2O2、MDA含量、細胞死亡、PAO、BrPAOs)則呈現相反的變化趨勢。這些結果說明肉桂醛能夠顯著逆轉Se脅迫對植物造成的生理效應。

同時，為了進一步總結肉桂醛的調控模式，將所有生理參數指標在不同處理方式下(CK、Se、Se+CA50)進行 Pearson 相關性分析，Pearson相關系數值介于-1和+1之間[24]。結果(圖 8，B)顯示：不結球白菜幼苗生長指標根長與鮮重呈正相關，它們分別與其他生理指標呈負相關。H2O2、MDA含量和細胞死亡呈正相關，H2O2、MDA 含量和細胞死亡分別與生長指標(根長、鮮重)呈負相關，說明 H2O2導致MDA含量累積，造成細胞死亡，進而影響生長；PAO(Spd)、PAO(Spm)活性以及BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6表達量均與H2O2含量呈正相關，BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6表達量與PAO(Spd)活性的相關性高于與PAO(Spm)活性的相關性，PAO(Spd)活性與H2O2含量的相關性高于PAO(Spm)活性，說明BrPAO3、BrPAO5、BrPAO6激活PAO(Spd)效率高于PAO(Spm)，進而影響H2O2累積。BrPAO調控H2O2生成的效率順序為：BrPAO3>BrPAO6>BrPAO5。這些相關性分析結果進一步證明：肉桂醛通過抑制PAO- H2O2信號模塊，進而減少H2O2累積和細胞死亡，從而緩解硒脅迫對植物生長的抑制效應。

3 討 論

高劑量的硒會導致植物中毒，進而造成植物生長受阻[25]。前人研究發現，煙草生長在土壤硒含量≤1.00 mg· kg-1時得到促進，而在土壤硒含量≥1.75 mg· kg-1則受到抑制[26]；當Na2SeO3超過20 μmol·L-1時，黃瓜植株表現出生物量下降及脂質過氧化水平增加[27]；高濃度硒 (≥10 mg· kg-1) 還能抑制人參菜株高、莖粗、根長的增加，從而導致人參菜生物量的降低[28]。本研究發現，硒脅迫可顯著抑制不結球白菜幼苗的根生長，其根長和根鮮重在Na2SeO3超過20 μmol·L-1時顯著下降。

ROS過量累積進而導致脂質過氧化和細胞死亡，是植物產生硒毒害的重要原因[29]。本研究發現硒脅迫對不結球白菜幼苗根細胞造成了嚴重的氧化損傷和細胞死亡效應；而肉桂醛作為一種具有抗氧化活性的天然化合物，其能夠激活不結球白菜幼苗植株對硒脅迫的耐性；聚類和相關性分析表明，肉桂醛可通過抑制ROS過量累積，進而顯著緩解上述硒脅迫誘導的損傷效應。

在逆境脅迫下，PAO代謝多胺產生H2O2是植物體內ROS產生的一個重要途徑[10]。高溫脅迫導致水稻植株PAO活性顯著上升[30]；缺氧脅迫導致甜瓜生長受到抑制，并伴隨著PAO活性和H2O2含量顯著增加[31]。本研究結果顯示，硒脅迫導致了不結球白菜根內PAO活性和H2O2水平的顯著上升，而加入肉桂醛則顯著降低了PAO活性和H2O2水平。這說明在硒脅迫條件下，肉桂醛可以通過抑制PAO活性減少ROS在不結球白菜根內的產生和累積。

硒脅迫可導致不結球白菜BrPAOs基因轉錄水平顯著上調。本實驗室前期研究發現BrPAOs分為3個亞家族[12]。BrPAO1屬于亞家族Ⅰ，參與多胺的末端分解代謝，推測Spd和Spm都可能是其催化底物；BrPAO2-6屬于亞家族Ⅱ，可能參與多胺的反向轉化(Spm→Spd或者Spd→Put)途徑，具有催化底物多樣性。本研究發現硒脅迫顯著誘導不結球白菜根內BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6表達水平上調，而且硒脅迫下誘導的PAO活性在以Spd為催化底物時相對更高。這說明不結球白菜在響應硒脅迫的過程中，BrPAO3、BrPAO5和BrPAO6可能更傾向于以Spd為底物的多胺逆向轉化。加入肉桂醛后可抑制上述3個BrPAO基因的表達，又說明肉桂醛可在轉錄水平發揮作用調控植物體內PAO活性。后續研究將結合生物化學方法進一步鑒定不同BrPAO的催化功能，將有助于深度揭示肉桂醛參與調控植物體內多胺代謝對逆境的響應方式。

肉桂醛具有抗氧化作用，可以有效降低動物細胞中ROS累積。肉桂醛通過激活酶促和非酶促抗氧化途徑有效降低關節炎大鼠ROS累積[32]。肉桂醛預處理增加了 SOD 活性并降低了心肌中的氧化損傷水平，對心臟起到保護作用[33]。這表明肉桂醛針對動物細胞的抗氧化特性體現為清除過量產生的ROS。而本研究結果表明，肉桂醛通過調控不結球白菜PAO-H2O2系統直接抑制ROS的過量生成來緩解硒脅迫。這說明肉桂醛針對真核細胞的抗氧化作用主要表現為兩方面：一是清除已經過量產生的ROS，二是阻斷部分ROS的過量產生。深入研究比較肉桂醛在動物和植物細胞中不同的作用方式，將有助于進一步解析肉桂醛抗氧化特性的作用機制。本研究初步發現了肉桂醛調控植物耐受硒脅迫的生物特性和作用方式，即肉桂醛抑制PAO-H2O2系統緩解硒脅迫，為進一步深度解析植物源天然化合物肉桂醛緩解植物硒毒害的信號調控網絡提供了工作基礎，并為農業生態環境中硒肥的合理施用調控提供了理論依據。