黃腐酸對水稻幼苗根系生長的影響及其與生長素的關系

王瀟瀟，伍 宏，陳思衡，甘立軍

(南京農業大學 生命科學學院，南京 210095)

高等植物根系的生長發育在其生長過程中起著非常重要的作用，植物根系類型可大致分為兩類：擬南芥等雙子葉植物所具有的直根系和水稻等單子葉植物所具有的須根系[1,2]。須根系主要由種子根、側根與不定根組成。水稻萌發時形成一條種子根，隨著幼苗的發育產生數目較多的不定根，主根和不定根都可以在中柱鞘上發育出側根，以便更多地吸收水與養分[3-6]。

黃腐酸(fulvic acid, FA)與腐殖酸(humic acid, HA)是土壤腐殖質(humus, HS)的主要成分[7-8]。FA具有良好的水溶性，且在酸、堿條件下均可溶解[9]。早期在擬南芥和番茄上的研究表明，FA可通過調控生長素的信號轉導來促進根的伸長生長和側根發生。Schmidt等[10]向無菌培養基中添加FA后，野生型擬南芥的根毛數量和長度增加，而生長素相關的突變體則無此效應。Canellas等[11]用FA處理野生型番茄后其側根數量增加，但FA不能促進生長素響應缺陷突變體dgt的側根發生。通過GUS染色的方法研究擬南芥側根起始點的IAA響應也發現，外源施加FA可以引起與IAA處理相同的轉錄活性，且可被IAA抑制劑如2-(對-氯苯氧)-異丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)抑制。這些證據均表明，外源FA可能通過影響生長素信號通路來調控植物的根系生長和發育。

目前關于FA對植物生長的促進作用在水稻中的研究尚少。水稻為單子葉植物，其根系形態與擬南芥等雙子葉植物有很大差別，側根發生的過程也不盡相同。過往研究中關于FA對水稻的作用，多為研究大田環境中FA對重金屬離子吸收的影響[12-16]，或籠統地研究土壤中提取的HS混合物對水稻生長的影響[17-18]。具體到FA對于水稻根系生長的作用以及相關機理研究較少。本實驗研究了FA對水稻幼苗根系發育的影響，并初步探究了FA和生長素在調控水稻幼苗根系的生長和發育中的相互關系。為生產實踐中應用FA調控水稻根系生長、培育優質水稻苗提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 種子和試劑

本試驗參試水稻(OryzasativaL.)品種為‘寧粳6號’，種子購自蘇紅旗種業股份有限公司。試驗所用試劑黃腐酸(FA)購自上海邦景實業有限公司，生長素合成抑制劑4-聯苯硼酸(4-biphenylboronic acid, BBo)、4-苯氧基苯基硼酸(4-phenoxyphenylboronic acid, PPBo)以及生長素極性運輸和信號轉導抑制劑三碘苯甲酸(triodobenzoic acid, TIBA)、對氯苯氧基異丁酸(p-chlorophenoxy isobutyric acid, PCIB)均為Sigma公司產品。

1.2 種子萌發與植株培養

選取形狀飽滿、大小均勻且無病蟲害的水稻種子，將種子浸泡于含有0.04%苯菌靈的去離子水中，30 ℃下浸種 1 d 后用去離子水洗凈種子。把種子置于濕潤的吸水紙上，于30 ℃的黑暗培養箱中萌發。當大多數種子萌發至種子根長約 1 cm 時，將根長一致的種子移栽到含有1/4 IRRI營養液的塑料水杯中處理。水杯四周和底部包裹避光。

1.3 FA和生長素抑制劑處理

1.3.1 FA處理使用含有不同濃度(50、100、200、400和800 mg·L-1)FA的營養液處理水稻幼苗。將FA溶解于營養液中并調節pH至5.0，營養液每 3 d 更換一次，每處理3次重復。處理 6 d 后采收植株進行數據測定。

1.3.2 IAA抑制劑處理使用少量二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)分別溶解BBo和PPBo制成母液，配置為含有3 μmol·L-1BBo和3 μmol·L-1PPBo的1/4 IRRI營養液。使用少量DMSO溶解PCIB制成母液，配置為含有30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA的1/4 IRRI營養液。水稻幼苗在上述培養液中培養6 d。

1.3.3 FA與IAA抑制劑共同處理使用少量DMSO溶解BBo、PPBo、PCIB和TIBA，加入含400 mg·L-1FA的營養液中，分別配置為含有 3 μmol·L-1BBo、3 μmol·L-1PPBo、30 μmol·L-1PCIB和 1 μmol·L-1TIBA 的1/4 IRRI營養液。為避免不同溶劑影響實驗結果，所有處理組的營養液中DMSO濃度相同。水稻幼苗在上述培養液中培養6 d。

1.4 根系形態觀測

FA處理6 d 后，收獲水稻幼苗，以去離子水洗凈根系。選取長勢相對一致的幼苗，使用刻度尺測量其種子根長、人工計數種子根上所有長度大于0.5 mm的側根數量；以刻度尺測量側根的長度，并計算其平均值；以種子根上所有側根數量除以種子根長，得到幼苗的側根密度。

1.5 根尖IAA含量測定

處理6 d 后，收獲水稻幼苗，用去離子水洗凈根系。迅速剪下幼苗的所有根尖(距離根尖端2 cm長)；取0.25 g根尖樣品加入4 ℃預冷的甲醇2 mL，在液氮中冰凍研磨后加入甲醇，置于4 ℃浸提 18 h；10 000 r·min-1、4 ℃ 離心20 min，取上清液過預先用2 mL甲醇處理過的C-18固相萃取柱，然后用N2吹干，-80 ℃冰凍保存。采用ELISA法檢測樣品中的IAA含量[19]。

1.6 數據統計分析

采用SPSS軟件進行單因素方差分析、雙因素方差分析和多重比較，用GraphPad軟件制作圖表。

2 結果與分析

2.1 FA濃度對水稻幼苗根長以及側根發生的影響

在含有不同濃度的FA中水培 6 d 的水稻幼苗根系照片(圖1，A)顯示，FA處理促進了水稻幼苗種子根和側根的伸長生長；100、200、400和800 mg·L-1FA處理水稻種子根長分別比對照顯著增加15.72%、28.1%、34.1%和41.02%(圖1，B)， 400和800 mg ·L-1FA處理的平均側根長分別比對照顯著增加了39.1%和56.0%(圖1，C)。同時，水稻幼苗種子根上的所有側根的數量(長度大于0.5 mm)隨著FA濃度上升而逐漸增加，當FA濃度 ≥ 100 mg·L-1時與對照組均有顯著差異，增幅分別達到25.6%、50.1%、87.4%和126.8%(圖1，D)。另外，FA處理也增加了水稻幼苗根系的側根密度，并有隨FA濃度上升而增加的趨勢，且在400和800 mg ·L-1FA處理下與對照差異顯著，如400 mg·L-1FA 處理的側根密度為對照的1.67倍。考慮到FA的劑量和效應，本研究選擇400 mg·L-1FA進行后續實驗。

2.2 FA濃度對水稻幼苗根尖游離IAA含量的影響

為了確定FA對水稻內源IAA含量的影響，選擇了25、100和400 mg·L-1FA處理水稻幼苗，6 d后檢測幼苗根尖的游離IAA含量。結果(圖2)表明，水稻幼苗根尖游離IAA含量在25 和100 mg·L-1FA處理下與對照無顯著差異，但在400 mg·L-1FA處理下比對照組顯著提高1.81倍。

2.3 生長素合成抑制劑對FA誘導的根伸長生長及側根發生的影響

BBo和PPBo可抑制擬南芥生長素合成途徑中的關鍵酶黃素單加氧酶(YUCCA)的活性，從而抑制IAA的生物合成[20]。圖3顯示，在不添加FA條件下， 3 μmol·L-1BBo 處理可使幼苗的種子根長比對照(CK)顯著增加13.16%(圖3，A)；3 μmol/L BBo 或 PPBo使幼苗的平均側根長比CK分別顯著降低38.7%和29%(圖3，B)，但對側根數量沒有顯著影響(圖3，C)；由于這些IAA合成抑制劑促進了種子根的長度增加，因此使其側根密度受到顯著抑制(圖3，D)。

同時，在添加FA的條件下，研究IAA是否參與FA調控的水稻根的生長。結果發現，FA與BBo 或PPBo 共同處理顯著降低了FA對種子根伸長生長的促進作用。其中，與FA處理相比，FA+BBo和FA+PPBo 共同處理幼苗的種子根長略有下降，它們的側根長分別顯著降低66.3%和71%(圖3，B)，而其側根數量分別顯著降低80.9%和80%(圖3，C)，IAA合成抑制劑與FA共同處理也顯著降低了幼苗的側根密度(圖3，D)。另外，FA與對照、FA+BBo與BBo 、FA+PPBo 與PPBo處理相比，幼苗的根系生長指標均顯著增加，進一步證明FA對種子根伸長生長的促進作用。

2.4 生長素極性運輸和信號轉導抑制劑對FA誘導的根伸長生長及側根發生的影響

PCIB和TIBA分別是生長素的信號轉導和極性運輸抑制劑。PCIB和TIBA 處理的水稻幼苗平均種子根長均比對照組顯著下降，分別為對照的42.0%和27.4%(圖4，A)；PCIB 處理的平均側根長也受到極顯著的抑制，僅為對照組的37.1%，而TIBA 處理幼苗的平均側根長與對照組無顯著差異(圖4，B)；與對照相比，PCIB 和 TIBA處理均對水稻幼苗的側根數量有極其顯著的抑制效果(圖4， C)，并顯著降低水稻幼苗的側根密度(圖4，D)。

同時， PCIB和TIBA與FA共同處理組的水稻種子根長均比FA處理組顯著降低，分別為FA處理的48.3%和82.0%(圖4，A)；與FA處理相比，FA+PCIB 處理幼苗的平均側根長顯著降低了75.3%，但FA+TIBA處理對側根長度沒有顯著的影響(圖4，B)； FA+PCIB 和FA+TIBA處理的幼苗側根數量均比FA處理顯著降低，分別為FA處理的7.2%和57.3%(圖4，C)；FA+PCIB處理幼苗的側根密度也比FA處理顯著降低，僅為FA處理的19.1%，而FA+TIBA 處理側根密度與FA處理沒有顯著差異(圖4，D)。另外，與不添加FA各處理(control、PCIB、TIBA)相比，相應添加FA處理幼苗的種子根長、平均側根長、側根數量和側根密度均不同程度增加，且FA和TIBA+FA處理的增幅均達到顯著水平。

3 討 論

近幾十年來腐殖酸的相關研究表明， 包括FA在內的多種腐殖酸對植物的生長發育有多種促進作用，因此腐殖酸被廣泛應用于農業領域。農業上FA主要應用于葉面肥或于復合肥中，通過添加適量FA提升肥料利用率，以及將FA作為土壤改良劑用以改良長期使用化肥而板結的土壤。

本研究在水培條件下使用50～800 mg·L-1FA處理水稻幼苗，發現FA達到一定濃度(≥ 100 mg·L-1)后顯著促進幼苗根系伸長生長和側根發生。HA與FA均是HS的有效組分之一，在Zandonadi等[13]的研究中，使用從土壤中提取的HA處理可以顯著促進玉米幼苗的側根發生；Mora 等[21]的研究表明HA處理的黃瓜根長和根系密度顯著增加。在本研究中FA對水稻幼苗側根發生的促進作用與上述的研究結果一致，FA有與HA類似的促進植物根系伸長生長和側根發生的效果。

生長素類植物激素在植物根系的生長發育過程中起著非常重要的作用，其極性運輸和信號轉導途徑被認為與根系生長尤其是側根發生關系極為密切。生長素的極性運輸可以改變植物局部組織的生長素濃度[22]。植物根系中生長素的極性運輸存在環流，即生長素沿著中柱往根尖運輸，至根冠后再通過表皮和皮層細胞回流向上運輸[23-24]。生長素的極性運輸主要通過AUX與PIN蛋白家族調控完成[24-27]，一些PIN蛋白突變體的側根密度會產生一定變化，如atpin3突變體的側根密度明顯減少[24]，而atpin2的側根密度增多[28]。在生長素信號轉導途徑對側根發生的調控研究中，目前有一種假說認為側根發生的調控有兩個關鍵點，一是處在合適位置的中柱鞘細胞才能形成側根原基，一是基部分生組織存在的節律性生長素信號會影響中柱鞘細胞的激活，當原生木質部細胞的生長素濃度最大時，緊鄰的中柱鞘細胞就可以開始分裂并逐步形成側根原基[29-30]。此外，中柱鞘細胞局部的生長素信號可決定側根的發生與發育，當生長素在中柱鞘細胞中累積到一定程度后，就可以促進中柱鞘細胞分裂形成側根原基。如果阻斷生長素信號，如使用生長素信號轉導抑制劑，就可抑制側根發生[31]；如果施加外源生長素，可使整個緊鄰木質部的中柱鞘細胞都被激活，則可以發育成側根[32]。目前的假說還有待完善，但在一定程度上解釋了側根發生與生長素信號之間的聯系。

生長素的各類抑制劑對植物的根系發育也有一定影響。Kakei 等[20]的研究表明，在含有1 μmol·L-1IAA合成抑制劑BBo 或PPBo的培養基上生長的擬南芥內源IAA含量顯著下降，擬南芥根的伸長生長受到顯著抑制。3 μmol·L-1BBo 或PPBo 處理下擬南芥的正常生長受到嚴重抑制，擬南芥植株表現出明顯的向重力性缺失，且初生根幾乎不生長。因此，本研究中選用了3 μmol·L-1作為BBo 和PPBo的工作濃度。本研究在水稻上的試驗結果與擬南芥的相關結果相吻合，3 μmol·L-1BBo 或PPBo 處理顯著抑制了水稻根系的伸長生長與側根發生。Yin等[33]在水培條件下使用PCIB處理水稻，0.5～50 μmol·L-1PCIB可顯著增加水稻根長，PCIB濃度超過50 μmol·L-1后顯著抑制水稻根長。對此作者推測低濃度的PCIB使得水稻根系的IAA信號處于一個更適合根系伸長生長的強度，高濃度下則顯示出對根系生長的抑制作用。本研究發現30 μmol·L-1PCIB處理對水稻幼苗的根系伸長生長以及側根發生均有顯著的抑制作用。綜合來看，BBo、PPBo對水稻幼苗種子根長的影響和PCIB對種子根長的影響有著相似的趨勢：即這些抑制劑在達到一定濃度后使根系中IAA信號水平顯著下降，從而抑制根系的生長發育過程。

目前已在擬南芥和番茄等植物中對腐殖質促進植物根系生長的效應做了一些研究。HS可以促進野生型番茄的側根發生，但番茄生長素不敏感突變體dgt側根發生被抑制且無法被HS恢復[11]。Trevisan等[34]的研究表明，如果使用TIBA或PCIB與HA共同處理AUX1-DR5∷GUS轉基因擬南芥，擬南芥中AUX1表達與只接受外源HA處理組相比受到顯著抑制，幼苗的側根密度也顯著下降。HA對擬南芥和番茄幼苗側根發生的促進作用與根系內源IAA含量以及IAA的信號轉導通路有關。

在本研究中，IAA合成抑制劑可抑制FA對水稻幼苗種子根伸長生長以及側根發生的促進作用。此外，對水稻根尖內源IAA含量的測定顯示400 mg·L-1FA顯著增加水稻根尖內源IAA含量，可推測在水稻中FA可能通過增加內源IAA含量的方式達到促進根系伸長生長與側根發生的效果。FA可促進水稻根系內源IAA含量上升，推測可因此促使更多的中柱鞘細胞分裂并形成側根原基，增加側根原基的數量，從而提高側根密度。此處需進一步的研究確認其中的具體機制。

IAA信號轉導抑制劑可顯著抑制FA對幼苗根系伸長生長與側根發生的促進作用。FA對水稻幼苗側根發生的促進作用與HA對擬南芥側根發生的促進作用一致[35]，促進作用可以被PCIB抑制的結果也與Mora等關于HA的研究結果一致[21]。本研究中TIBA可顯著抑制FA對水稻幼苗種子根伸長以及側根發生的促進作用，但無法抑制FA對水稻幼苗側根伸長生長的促進作用，表明FA對水稻幼苗根系伸長生長的效應可能存在不受IAA極性運輸以及信號轉導影響的途徑，而FA對水稻幼苗側根發生的促進作用受到IAA極性運輸以及信號轉導途徑影響。植物體中PCIB可通過干擾泛素-蛋白酶體途徑抑制Aux/IAA蛋白降解，從而抑制受IAA調控的基因轉錄和表達，顯示出根系生長受阻、側根發生受抑制和向重力性下降的表型[36]。FA對根系伸長生長與側根發生的促進作用被PCIB抑制，當PCIB阻礙了水稻體內的IAA信號識別過程時，FA對水稻幼苗根系生長的促進作用便受到抑制。這表明FA對水稻幼苗根系生長的促進作用需通過IAA信號轉導通路實現。