‘金冠’蘋果及其優系(SGP-1)果實發育期間有機酸代謝特征比較

楊文淵，謝紅江，陶 煉，宦云敏，陳善波，林立金，廖明安*

(1 四川農業大學 園藝學院，成都 611130；2 四川省農業科學院園藝研究所，成都610066；3 農業部西南區域園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，成都 610066；4 四川省林業科學研究院，成都 610081)

果實中有機酸的代謝是一個復雜的生理過程，包括酸的合成、降解、利用及區域化的平衡，且有機酸含量及組分比例是決定果實酸度及風味的重要組成因子[1]。因此，揭示果實中有機酸的調控機制對果實品質調控及良種培育具有重要的意義。蘋果成熟果實中有機酸以蘋果酸為主，占60%以上，高的可占97%[2-4]，奎寧酸、檸檬酸、酒石酸、莽草酸、琥珀酸等含量低[5-6]。通常有機酸在果實生長過程中積累，在成熟過程中作為糖酵解、三羧酸循環(TAC環)等呼吸基質，以及糖原異生作用基質而被消耗，其合成和降解過程是在酶促反應下進行的。蘋果果實中蘋果酸的積累受代謝關鍵酶調控，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和蘋果酸脫氫酶(MDH)負責蘋果酸合成，蘋果酸酶(ME) 和磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)負責蘋果酸的降解，液泡膜上的2個質子泵H+-ATPase(VHA)和H+-焦磷酸酶(VHP)為蘋果酸的跨膜運輸提供能量，目前已在蘋果[1,7-9]、歐李[10]、杏[11]、桃[12-13]等多種果實中證實以上6種代謝相關酶活性是影響蘋果酸積累速率的決定因素，但它們具體的作用機制還不太清楚。

經過多年生產實踐，發現‘金冠’蘋果自然變異材料1份(暫定名‘SGP-1’)，具有低酸、少銹、耐貯藏等優良性狀，彌補了‘金冠’蘋果易感銹、果酸味濃、易發綿等不足。本研究擬通過測定‘金冠’蘋果及其優系‘SGP-1’果實發育期間有機酸組分和含量以及蘋果酸代謝相關酶活性，分析有機酸含量變化規律及其與蘋果酸代謝相關酶的關系，明確有機酸積累的關鍵時期和關鍵酶，探討‘金冠’和‘SGP-1’果實全發育期有機酸積累的生理差異，為調控蘋果果實酸度提供理論依據，也為深入研究‘SGP-1’果實有機酸代謝的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 參試材料及樣品采集

供試材料為四川省阿壩州蘋果園‘金冠’蘋果及其優系‘SGP-1’的果實。在2019年4～9月，選取生長勢基本一致的3株蘋果樹進行樣品采集，在花后7 d開始采集樣品，以后每20 d取1次樣，直至果實達到生理成熟(花后160 d左右)，1共取9次樣。幼果期至成熟期果實大小差異較大，因此每次取果量應根據果實大小而定。樣品采集后，果實帶皮去心切碎，迅速用液氮冷凍(-196 ℃)后混勻，分兩份置于超低溫冰箱(-80 ℃)備用，一份用于檢測有機酸組分及含量，另一份用于分析蘋果酸代謝酶活性。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 果實中酸組分及含量果實中酸組分提取和測定參照劉雅蘭[14]、張麗麗等[15]的方法并略加改進。稱取液氮研磨成粉的果肉2 g左右(計重)，加入4 mL 0.2%偏磷酸，搖勻，常溫超聲提取20 min，8 500 r/min離心10 min，殘渣中再加入4 mL偏磷酸再次提取，合并上清液并定容到10 mL，經0.45 μm濾膜過濾，獲得樣品提取液待測。色譜條件：Agilent高效液相色譜儀(Agilent1260Ⅱ)，色譜柱為C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為純甲醇：0.02 mol/L K2HPO4(pH 2.6)= 3∶97，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μL。色譜純級的標準樣品蘋果酸、奎寧酸、檸檬酸和酒石酸由Sigma公司提供，用超純水分別制備成系列混合標準溶液。將系列混合標準溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾到2 mL進樣瓶中，進樣后以峰面積(X)對濃度(Y)求回歸方程和相關系數。將處理后的樣品提取液進行液相色譜分析，進樣量為10 μL，采用外標法定量。有機酸含量為各酸組分相加之和。

1.2.2 果實中蘋果酸代謝相關酶活性樣品酶提取液制備參照 Hirai 等[16]和 Sadka 等[17]的方法。將0.5 g 果肉用 3 mL 的提取緩沖液[0.2 mol·L-1Tris-HCl 緩沖液(pH=8.2)、0.6 mol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1異抗壞血酸]在冰上勻漿，8 000 g、4 ℃離心 10 min，取上清液置冰上，用于酶活性的測定。按照酶試劑盒說明書分別測定MDH、PEPC、ME、PEPCK、VHA和VHP活性，采用酶標儀分光光度法測定吸光度(OD)值變化，每30 s記錄1次OD值，重復3次(1 min為1次重復)，共記錄3 min，以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位(U)，酶的活性以單位每克鮮果肉每分鐘表示(U·g-1·min-1)。

1.3 數據統計分析

用 Excel 2010 軟件進行數據整理和繪圖，測定結果以平均值±相對標準偏差表示，應用 SPSS20 進行差異顯著性分析(Duncan’s新復極差法，0.05水平上測試)和相關性分析(Pearson法)。

2 結果與分析

2.1 ‘金冠’及‘SGP-1’果實發育過程中主要有機酸含量比較

2.1.1 有機酸含量在整個果實發育期，‘SGP-1’果實有機酸含量始終顯著低于‘金冠’果實；二者果實有機酸含量隨發育期的變化趨勢基本一致，均先升后降，并在花后27 d達到最高值，分別達到21.17 mg·g-1和23.74 mg·g-1(圖1)。其中，‘SGP-1’有機酸含量在花后47～67 d快速下降，降幅在50%左右，在花后87～127 d有機酸含量趨于穩定；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’和‘金冠’果實有機酸含量分別急劇下降至0.70 mg·g-1和1.40 mg·g-1，分別僅為峰值的3.31%和5.90%。總之，兩材料果實有機酸含量隨發育期的變化趨勢相似，但‘SGP-1’下降較早且快，自花后67 d開始，‘SGP-1’有機酸含量僅為‘金冠’的一半，并持續到果實成熟。

2.1.2 蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和檸檬酸含量‘SGP-1’和‘金冠’果實有機酸主要由蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和檸檬酸組成，幼果期均以奎寧酸為主，分別占比87.40%和64.00%，成熟期均以蘋果酸為主，分別占比50.10%和74.20%。

首先，在整個蘋果果實發育期，‘SGP-1’果實蘋果酸含量始終顯著低于‘金冠’，僅為‘金冠’的8.4%～67.4%(圖2，A)。在幼果期(花后7～47 d)和膨大期(花后67～107 d)，二者果實蘋果酸含量變化趨勢不同，‘SGP-1’在花后7 d達到峰值(4.15 mg·g-1)，而后急劇下降至0.83～1.01 mg·g-1之間；而‘金冠’蘋果酸含量幼果期快速上升，于花后47 d達到最高值(9.88 mg·g-1)，隨后緩慢遞減，在花后107～127 d趨于穩定。在成熟期(花后127～167 d)，兩材料蘋果酸含量均急劇下降，僅為峰值的10%左右，此時‘SGP-1’蘋果酸含量是‘金冠’的1/3。可見， ‘SGP-1’蘋果酸積累的關鍵時期為果實發育初期，而‘金冠’蘋果酸積累關鍵期是幼果期和膨大期。

同時，‘SGP-1’和‘金冠’果實中奎寧酸和酒石酸含量變化趨勢一致，總體呈現先升后降的特征(圖2，B、C)。在幼果期，‘SGP-1’果實兩種酸含量大多顯著高于‘金冠’，且峰值均出現在花后27 d；‘SGP-1’和‘金冠’果實奎寧酸含量峰值分別為18.49 mg·g-1和15.19 mg·g-1；‘SGP-1’奎寧酸含量在幼果期比‘金冠’高出21.81%～37.41%(圖2，B)，彌補了其蘋果酸含量的不足(圖2，A)，使得兩材料有機酸整體含量變化趨于一致(圖1)。在以后發育期，兩材料果實奎寧酸和酒石酸含量均快速減少，至成熟期兩材料間差異不顯著。

另外，在整個果實發育期，‘SGP-1’和‘金冠’果實中檸檬酸含量變化趨勢一致(圖2,D)。在果實發育初期，‘SGP-1’檸檬酸含量顯著高于‘金冠’，并在花后7 d就達到峰值(0.67 mg·g-1)，而后大幅下降；在花后67～87 d，‘SGP-1’檸檬酸含量顯著低于‘金冠’；在成熟期，二者檸檬酸含量趨于一致，差異不顯著。

2.2 ‘金冠’及‘SGP-1’果實發育過程中酸代謝相關酶活性比較

2.2.1 MDH和PEPC活性‘SGP-1’和‘金冠’果實中MDH活性在果實發育過程中整體呈‘U’型變化，幼果期和成熟期MDH活性較高，膨大期活性較低(圖3,A)。其中，兩材料MDH 活性峰值出現時間不同，分別在花后47 d(52.42 U·g-1·min-1)和167 d(36.68 U·g-1·min-1)；除花后87 d和167 d外，其余時段兩材料MDH活性差異達到顯著水平。在幼果期，兩材料MDH活性變化趨勢相反，且‘SGP-1’中的MDH活性是‘金冠’的2倍左右，說明在幼果期‘SGP-1’蘋果酸的合成途徑更活躍。

同時，‘SGP-1’和‘金冠’果實中PEPC活性變化趨勢一致，均整體上先降后升，峰值均出現在花后7 d，分別為21.13 和17.10 U·g-1·min-1(圖3,B)。在幼果期，‘SGP-1’中PEPC活性顯著高于‘金冠’，最大差距為4倍，且降幅遠小于‘金冠’；‘金冠’PEPC活性僅在花后107 d快速回升并顯著高于‘SGP-1’，而后又快速下降，至成熟期，兩材料PEPC活性均快速增加，并趨于一致，差異不顯著。

2.2.2 ME和PEPCK活性由圖4,A可知，‘SGP-1’和‘金冠’果實中ME活性隨著生育期的變化趨勢基本一致，在幼果期最高，后隨著果實發育快速下降，而在膨大期和成熟期又有所回升；整個發育期出現3個小高峰，最大值在花后27 d，‘SGP-1’和‘金冠’分別為42.36 和27.04 U·g-1·min-1。‘SGP-1’的ME活性在花后7～87 d顯著高于‘金冠’，差距在2～3倍；在花后107 d，‘金冠’的ME活性快速上升，顯著超過‘SGP-1’；在果實成熟時，兩材料的ME活性差異達到顯著水平。

同時，兩材料果實中PEPCK活性隨發育期的變化趨勢也基本一致，在幼果期最高，并在花后27 d達到峰值，‘SGP-1’和‘金冠’分別為56.65 和38.50 U·g-1·min-1，而后快速下降，成熟期略有所回升(圖4,B)。‘SGP-1’的PEPCK活性在幼果期顯著高于‘金冠’，而在成熟期顯著低于‘金冠’。

2.2.3 VHA和VHP活性‘SGP-1’和‘金冠’果實中質子泵VHA活性隨生育期的變化趨勢基本一致，整體呈“W”型，在發育初期、膨大期和成熟期出現3個小高峰(圖5，A)。其中，‘SGP-1’果實的VHA活性在花后7～87 d顯著高于‘金冠’；之后，隨著果實發育，‘SGP-1’的VHA活性先下降后上升，在花后87 d達到最大值而后持續下降；到成熟時顯著低于‘金冠’，僅為‘金冠’的三分之一。

同時，由圖5，B可知，兩種材料果實的質子泵VHP活性變化趨勢也一致，隨著果實發育先上升后下降再上升，并在幼果期和成熟期表現出較高活性。

表1 ‘金冠’和‘SGP-1’果實蘋果酸與其代謝相關酶活性的相關系數

‘SGP-1’果實VHP活性在幼果期顯著高于‘金冠’，從花后67 d開始則顯著低于‘金冠’；特別在花后107 d至成熟期，‘金冠’果實中VHP活性快速增加，一直保持較高水平，顯著高于‘SGP-1’，約是‘SGP-1’的2～3倍。

2.3 ‘金冠’及‘SGP-1’果實蘋果酸含量與其代謝酶活性的相關性

相關性分析表明(表1)，在幼果期(花后7～47 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與PEPC和VHA活性呈極顯著正相關，與MDH活性呈顯著負相關，而‘金冠’蘋果酸含量與MDH、PEPC和VHA活性均呈極顯著負相關；在果實膨大期(花后67～107 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與MDH、PEPC活性呈極顯著負相關，與PEPCK、VHA活性呈顯著正相關，而‘金冠’蘋果酸含量則與PEPC、ME、VHP活性呈極顯著或顯著負相關；在成熟期(花后127～167 d)，‘SGP-1’蘋果酸含量與MDH、PEPC、ME、VHA和VHP活性均呈極顯著或顯著負相關，而‘金冠’蘋果酸含量則與MDH、PEPC、ME和VHP均呈極顯著或顯著負相關。由此可知，對‘SGP-1’和‘金冠’蘋果酸積累起主要調控作用的關鍵酶在幼果期和膨大期存在較大差異，幼果期負責蘋果酸合成的關鍵酶不同，而膨大期負責蘋果酸降解和運輸的關鍵酶不同，成熟期基本一致。

3 討 論

本研究對‘SGP-1’和‘金冠’蘋果果實發育過程中有機酸及各組分含量變化進行了分析，二者差異達到顯著水平。特別是‘SGP-1’蘋果酸含量變化規律與‘金冠’相反，至成熟時只有‘金冠’的三分之一；加之，‘SGP-1’來源于‘金冠’變異優系，二者遺傳背景相似，從果實發育期間各酸組分含量、蘋果酸代謝關鍵酶活性及相關關系，探討果實發育過程中降酸途徑及 ‘SGP-1’果實低酸成因，對高糖低酸新品種培育具有重要意義。

本研究發現‘SGP-1’果實中主要影響蘋果酸合成(MDH、PEPC)、降解(ME、 PEPCK)和轉運(VHA和VHP)的關鍵酶活性，在幼果期均顯著高于‘金冠’，并沒有帶來‘SGP-1’果實蘋果酸的高積累，反而顯著低于‘金冠’；而且蘋果酸含量與兩個主要合成酶活性呈負相關關系，表明合成只是蘋果酸積累的前提但不是唯一的因素，高的合成不能直接導致高的積累。這與姚玉新[7]在蘋果中的研究結論一致。Beruter[18]研究也發現在高酸和低酸的“Usterapfel”蘋果成熟過程中兩種合成酶活性沒有差異。可見，蘋果酸合成不是果實酸度差異形成的關鍵因素，而參與降解的ME、PEPCK和為運輸提供能量的VHA和VHP的協同調控對蘋果酸含量變化及果實酸度差異形成起關鍵作用。

本研究結果表明負責蘋果酸降解的ME和PEPCK活性，在‘SGP-1’幼果期快速升高，且顯著高于‘金冠’，導致幼果期‘SGP-1’蘋果酸快速下降，積累偏少；而成熟期兩種材料蘋果酸含量急劇下降也伴隨有上述酶活性的回升，說明ME和PEPCK對兩種材料蘋果酸含量的下降起到重要作用，與前人在蘋果[7,19-20]、李[21]、櫻桃[22]上的研究結果一致。但它們是否受控制蘋果果實低酸性狀基因的調控，以及這些關鍵酶的作用都需進一步研究。

質子泵VHA和VHP為有機酸跨膜運輸提供能量[23]，對果實液泡有機酸的貯藏起到了關鍵作用，為代謝產物和離子的次級運輸提供能量[24]。本研究結果表明VHA和VHP的活性在果實發育過程中出現了3個小高峰，相關性分析也說明質子泵活性直接影響著蘋果酸的積累，幼果期和膨大期VHA發揮主要作用，而成熟期VHP作用更顯著。相似的研究在蘋果[7]、柑橘[25]、葡萄[26]和梨[27]上也被發現。特別是在‘金冠’蘋果果實成熟過程中兩質子泵活性顯著升高，增量大于‘SGP-1’，說明在酸度高的‘金冠’蘋果成熟過程中，需要提供更多能量來實現對蘋果酸的調節。但關于兩個質子泵是如何調節果實酸度、果實有機酸的跨膜運輸及調控機理等，還有待深入研究。

果實有機酸代謝是一個極為復雜的過程，不同果實中控制果實有機酸含量的分子機制至今還不完全清楚。前人從分子水平研究了控制李[28]、蘋果[29]果實酸度候選基因，為調控果實酸度奠定了基礎，針對‘SGP-1’與‘金冠’果實酸度的顯著差異和不同發育期起主要調控作用的關鍵酶不同，下一步可深入挖掘了‘SGP-1’果實酸度調控的關鍵基因，并分析它們的功能，對改善果實品質具有重要意義。

4 結 論

本研究證實了‘SGP-1’是以蘋果酸為主的低酸型‘金冠’蘋果變異優系，該發現為深入研究果實低酸形成機理和培育高糖低酸新品種奠定了基礎。本研究還發現‘SGP-1’蘋果酸積累的關鍵時期為果實發育初期，并在幼果期就快速下降；而‘金冠’蘋果酸積累關鍵期是幼果期和膨大期，至成熟期才快速下降。‘SGP-1’蘋果酸代謝相關酶活性在幼果期均顯著高于‘金冠’，成熟期持平或顯著低于‘金冠’；二者幼果期負責蘋果酸合成的關鍵酶不同，膨大期負責蘋果酸降解和運輸的關鍵酶不同，成熟期基本一致。