貴州核桃核心種質篩選與構建研究

曾欽朦，曾亞軍，陳勝群，侯 娜

(貴州省林業科學研究院，貴陽 550005)

種質資源為林木遺傳育種研究提供了大量的材料，但也增加了林木資源的管理成本及篩選優良種質材料的難度。Frankel 等[1]首次提出核心種質(core collection)的概念，Brown[2]在1989年將其進一步發展。構建核心種質不僅有利于種質資源的保存與評價，而且還能夠提高其利用效率[3-4]。構建核心種質時采用不同的取樣策略可確保構建核心集合的質量，核心種質要求以最小資源量最大程度地表示全部資源的遺傳多樣性，因此合理的取樣比例顯得尤為重要。林木核心種質的構建相較于農作物的構建起步較晚。目前，國內外對林木核心種質構建的研究主要樹種有歐洲黑楊[5]、美洲黑楊[6]、水青樹[7]、杉木[8]、杜仲[9]、樟樹[10]、大花序桉[11]、伊朗核桃[12]等。

核桃是中國乃至世界重要的果樹和木本油料樹種，因核桃仁營養豐富，風味獨特及用途多樣，躋身于世界著名的“四大干果”之首[13]。同時，核桃栽培在退耕還林、石漠化及水土流失治理和樹種結構調整等方面均有積極貢獻，兼具生態效益、經濟效益和社會效益[14]。貴州核桃種植主要是核桃(Juglansregia)和泡核桃(J.sigillata)2個栽培種，以泡核桃為主。同時，泡核桃也是中國特有種。貴州省核桃研究所查閱和收集了貴州88個核桃分布縣(市、區)的相關研究與開發利用圖片和政策文件，為了進一步提高貴州核桃種質資源利用效率，挖掘其優異基因，需進一步構建其核心種質資源庫。

本研究基于245份核桃種質資源的數量性狀，通過不同取樣策略及取樣比例篩選最適宜貴州核桃核心種質的構建方法，并構建核桃核心種質資源庫，旨在為貴州核桃種質資源保護、開發利用及新品種選育提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

根據當地林業部門和群眾提供的信息資料，最終選取19個縣(市、區)為核桃種質資源的調查區域，對貴州核桃種質資源進行系統收集。在每個縣、鄉核桃資源相對集中的區域，標記調查區域的地理坐標和行政位置、海拔，調查具有優異農藝性狀植株的生物學性狀、生長環境。經篩選共記錄了樹齡大于30年的核桃單株245株。本研究的試材名稱、采集地生態、地理信息及樣本數見表1。

表1 貴州核桃種質資源采樣點信息

1.2 測定方法

從245個單株中分別采集30個大小基本一致、飽滿的堅果帶回實驗室，晾干至恒質量后進行表型性狀的測定。堅果數量性狀中的縱徑、橫徑、側徑用游標卡尺(精度0. 01 mm)測量，單果質量、核仁質量用天平(精度0. 01 g)測量，果殼厚度用螺旋測微儀(精度0. 001 mm)測量。核仁脂肪及蛋白質含量測定參考GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》[15]和GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》[16]。

1.3 核心種質構建方法

1.3.1 主成分分析及聚類分析運用SPSS 26.0軟件將245份核桃種質資源的13個數量性狀數據先進行標準化處理，后進行主成分分析[17]，再利用歐氏距離和組間連接法通過逐步聚類的方法對其進行聚類，得到各個體間的聚類圖。

1.3.2 取樣策略目前，大量研究構建種質資源的取樣比例設定在5%～40%，但若總體樣本數量少的可增加取樣比例。本研究以245份核桃種質資源為試驗材料，設定8個取樣比例，分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%和50%，采用優先取樣[18]、偏離度取樣[19]和隨機取樣[20]3種取樣策略進行取樣(圖1)。

(1)優先取樣策略。根據聚類圖優先選擇最先聚在一起、具有最大或最小表型性狀極值的遺傳材料進入下一輪聚類，若各材料均具有極值則進入下一輪聚類，若各材料均無極值則隨機選擇一個材料進入下一輪聚類。

(3)隨機取樣策略。根據聚類的原理，最低分類水平的各組遺傳材料中隨機取一個材料進入下一輪聚類，如只有一個遺傳材料，則直接進入下一輪聚類；對所取遺傳材料再次進行聚類，按同樣方法取樣，經多次聚類、取樣，直至所取遺傳材料量達到核心種質的構建標準。

1.3.3 核心種質的評價及檢驗通過13個數量性狀數據，計算出各性狀的均值、標準差、方差、變異系數等；得出均值差異百分率(MD%)、極差符合率(CR%)、方差差異百分率(VD%)、變異系數變化率(VR%)、最大值變化率(CRMAX%)、最小值變化率(CRMIN%)、平均值變化率(CRMEA%)、表型方差(VPV)和表型保留比例(RPR%)9個參數[21]，利用9個參數評價所構建的核心種質，構建核心種質的最低標準是MD%≤20%，CR%≥80%[22]。比較不同方法所構建的核心種質，篩選出最佳方法。將篩選的核心種質各表型性狀進行t檢驗，驗證所構建的核心種質是否能有效代表原種質。

1.3.4 核心種質的確認采用Origin 2020b軟件，比較核心種質與原種質基于主成分分析的分布圖，運用SPSS 26.0軟件分別對構建的核心種質和原種質進行主成分分析，得到各主成分的累計貢獻率及得分情況，以此對核心種質進行確認，評價核心種質遺傳多樣性的高低和結構的保留水平。

2 結果與分析

2.1 主成分分析

采用SPSS 26.0軟件對245份核桃種質資源的13個數量性狀進行主成分分析，在13個主成分因子中前5個特征值的累計貢獻率為73.89%(表2)。其中,第1主成分占32.84%，第2主成分占13.03%，第3主成分占11.13%，第4主成分占8.61%，第5主成分占8.28%，說明數量性狀的主成分累計貢獻率較分散，累計增加較緩慢。對5個特征值分別計算各主成分值，并將其主成分值利用歐氏距離對245份個體進行聚類分析。

2.2 構建核心種質庫的取樣策略

2.2.1 優先取樣策略采用優先取樣策略抽取8個比例的種質資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結果見表3。其中，8個取樣比例的MD%均小于20%，CR%均大于80%，說明8個群體均符合核心種質的構建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。極差符合率、最大值變化率和最小值變化率均為100%，變異系數變化率和表型方差隨著取樣比例的增加而減少，表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當CR%≥80%，并且VR%與CR%越大，認為核心種質越能夠代表原種質的遺傳多樣性[15]；VPV越大，表明所構建的核心種質中各性狀的遺傳冗余度越小。取樣比例為5%時，VR%和VPV的值最大，分別為151.00%和22.48%，說明與其他相比，S1最能保證原種質的遺傳多樣性，且遺傳冗余度最小；因此，S1最能代表原種質，并得到25份核桃核心種質資源。

2.2.2 偏離度取樣策略采用偏離度取樣策略抽取8個比例的種質資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結果見表4。其中，8個取樣比列的均值差異百分率均小于20%， 極差符合率均大于80%，說明8個群體均符合核心種質的構建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。變異系數變化率、最小值變化率和表型方差均隨著取樣比例的增加而減少，最大值變化率、表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當取樣比例僅在50%時，極差符合率達到100%、均值差異百分率達到0。因此，D8最能代表原種質，并得到131份核桃核心種質資源。

表2 貴州核桃種質資源主成分分析結果

表3 優先取樣策略下貴州核桃種質資源與原種質性狀的差異百分率

2.2.3 隨機取樣策略采用隨機取樣策略抽取8個比例的種質資源，將其主成分值利用歐氏距離進行逐步聚類分析，結果見表5。其中，8個取樣比例的均值差異百分率均小于20%，極差符合率均大于80%，說明8個群體均符合核心種質的構建要求，能夠代表原群體的遺傳多樣性。最小值變化率隨著取樣比例的增加而減少，而最大值變化率、表型保留比例隨著取樣比例的增加而增加。當取樣比例僅在50%時，極差符合率達到99.37%、方差差異百分率和表型保留比例均達到最大，分別為46.15%和70.83%，因此，R8最能代表原種質，并得到132份核桃核心種質資源。

2.2.4 不同取樣策略的比較不同取樣策略構建的核心種質的參數見圖2。其中，核心種質D8和R8的均值差異百分率均為0.00%，且D8的CR%達到100%；而核心種質 S1的均值差異百分率為7.69%。

表4 偏離度取樣策略下貴州核桃種質資源與原種質性狀的差異百分率

表5 隨機取樣策略下貴州核桃種質資源與原種質性狀的差異百分率

D8的最大值變化率、最小值變化率、平均值變化率及表型保留比例均大于R8，且平均值變化率及表型保留比例也都大于S1。綜合考慮，偏離度取樣策略(D8)更適合構建核桃的核心種質資源庫，共構建131份核桃核心種質資源。

2.3 核心種質的評價與確認

2.3.1 核心種質的評價在50%的取樣比例下，131份核桃核心種質資源占原種質資源的實際比例為53.47%。對初步構建的核桃核心種質進行t檢驗。由表6可知，t檢驗的結果均不顯著，說明初步構建的核桃核心種質具有很好的代表性，與核桃原種質在各指標上相差不大。通過檢測核心種質13個數量性狀的平均值、變異系數與原種質的符合率，結果表明平均值的符合率高達97.08%以上，變異系數的符合率高達106.78%以上，說明初步構建的131份核桃核心種質是有效的，且具有原種質中各性狀的變異。

2.3.2 核心種質的確認將核桃原種質資源和131份核心種質資源利用主成分分析法進行確認，結果見表7和圖3。核桃原種質和核心種質的主成分分析結果(表7)顯示，原種質與核心種質均在第6個主成分時特征值小于1，原種質與核心種質的第5個主成分的特征值分別為1.076和1.064，累計貢獻率分別為73.89%和76.48%，說明核桃核心種質的貢獻率要高于原種質，核心種質在前5個主成分上能解釋13個表型數據76.48%以上的表型方差，有效減少了遺傳冗余度。同時，圖3的主成分圖結果顯示，核桃核心種質不僅包含了原種質的整個分布范圍，而且外圍具有特異性狀的種質也包含在內，表明構建的核桃核心種質的實用性及代表性得以確保，能夠更有效地將原種質的遺傳信息保留。

表7 貴州核桃原種質與核心種質的主成分分析

3 討論與結論

核心種質是能以最小資源量及遺傳重復性，最大程度地表示全部資源的遺傳多樣性。因此，評價構建的核心種質資源庫是否合適的關鍵步驟是對構建的核心種質進行檢驗，檢驗其遺傳多樣性的高低以及實用性的大小[4]。前人[15]通過比較各性狀的評價參數表明均值差異百分率(MD%)、極差符合率(CR%)、方差差異百分率(VD%)和變異系數變化率(VR%)比其他評價參數能更好地反映出構建的核心種質資源與原種質在均值、方差和變異系數方面的差異。構建的核心種質需具有異質性、多樣性及代表性的原則[23]，早期評價核心種質的代表性中，認為構建核心種質樣本的MD小于30%且VR大于70%才有效[21]；之后Hu等提出了更高的要求，認為核心種質具有較高的代表性，其MD小于20%且CR大于80%。此外，在評價構建核心種質的數量性狀時，應優先考慮CR、VD和VR。本研究構建的131份核桃核心種質，CR、VD、VR和MD值分別為100.00、15.38、112.23和0.00，根據前人的標準，所構建的核心種質是有效的。

取樣策略是構建核心種質的重要環節，它決定哪個種質有資格入選為核心種質。Hu等研究表明，隨機取樣策略可以保持原種質的遺傳多樣性形式；優先取樣策略能夠保留原種質資源的極端性狀及遺傳變異結構；偏離度取樣策略能夠保留原種質資源的最大遺傳變異水平[15]。3種取樣策略中絕大多數研究者認為其他聚類取樣策略優于隨機取樣策略，因為隨機取樣是盡可能地獲得原種質的無偏樣本，而無法保留原種質有效的遺傳多樣性[24]。李長濤等[25]認為偏離度取樣策略盡可能地保存了該物種的遺傳變異，也有利于根據各類型的遺傳多樣性狀況對種質的收集加以調節。鐘永達等利用872份中國樟樹種質資源的表型數據進行中國樟樹初級核心種質取樣策略的研究，結果表明優先取樣法構建的核心種質是最佳的[7]。馬玉敏用297個中國野生板栗的19個表型性狀構建核心種質庫，表明偏離度取樣策略是應用形態數據構建中國野生板栗核心種質最佳的取樣策略[24]。本試驗采用的3種取樣策略分別篩選出3種核心種質(S1、D8和R8)，優先取樣策略和偏離度取樣策略的極差符合率達到100.00%，雖然優先取樣策略的變異系數變化率高于偏離度取樣策略，但偏離度取樣策略的均值差異百分率為0.00%，表型保留比例遠高于優先取樣策略，從而能更有效地保存優異基因。因此，偏離度取樣策略是利用數量性狀數據構建貴州核桃核心種質最適宜的取樣策略。

確定適宜的取樣比例是構建核心種質的重要環節。當取樣比例過高，可能會導致構建的核心種質的冗余較高，并且很有可能對種質資源的保存與利用造成不利的影響；當取樣比例過低，可能會導致核心種質的代表性和多樣性下降，甚至會引起重要的種質資源丟失。大量的研究表明，不同物種的核心種質構建沒有固定的取樣比例，但總體而言原種質數量越多則取樣比例越小，原種質數量越少取樣比例就越大。Brown認為，當原種質資源的數量超過3 000時，總體取樣比例在5%～10%之間[26]；近年來，大多數學者認為總體取樣比例在5%～40%之間[27]。本試驗構建的核桃核心種質資源共有131份，取樣比例為50%，這與Yonezawa的標準不一致，但李自超等認為，當采集的種質資源數量越少，則取樣比例應相應加大[28]。張歡等以161份水青樹種質資源構建了核心種質72份，取樣比例為45%[4]。因此，本研究構建的核桃核心種質資源的取樣比例是較合理的。

構建核心種質的異質性和多樣性，即核心種質需保持原種質的形態特征及遺傳多樣性。絕大多數學者均采用主成分分析來比較核心種質與原種質的分布圖及分析結果來判斷核心種質是否能夠較好地保留原種質的形態特征和遺傳多樣性[29-30]。陳升侃等通過主成分分析對構建的斑皮檸檬桉核心種質進行進一步確認，結果表明前2個特征值的累計貢獻率高達94%以上，且核心種質和原種質的主成分分布圖具有相似的結構，說明所構建的核心種質能較好地代表原種質[31]；張歡等基于水青樹葉表型性狀構建的核心種質通過主成分分析進行確認，4個特征值的累計貢獻率達到83.37%[4]。本研究通過主成分分析對構建的核桃核心種質進行確認，前5個特征值的累計貢獻率達到76.49%，核桃核心種質與原種質的分布圖較為相似，這樣有效地保存了核桃原種質的遺傳結構和遺傳多樣性，并有效避免了種質的冗余。

綜上所述，本研究基于核桃種質資源數量性狀，分析了245份核桃種質資源13個數量性狀的主成分，在13個主成分因子中前5個特征值的累計貢獻率為73.89%，對5個特征值分別計算各主成分值，并將其主成分值利用歐氏距離對245份個體進行聚類分析，發現偏離度取樣策略和總體取樣比例為50%，是構建貴州核桃核心種質資源最適宜的方法。此方法構建了131份核桃核心種質資源，較好地代表原種質的異質性、多樣性和代表性，避免種質資源的冗雜。核桃核心種質的建立，為以后貴州核桃種質資源的保護奠定了基礎，對栽培與育種的研究者來說是非常珍貴的基因庫。目前，對于核桃種質資源的研究還處于初始階段，它所具有的特殊價值還需更進一步的挖掘。