養心定悸膠囊對糖尿病心肌病模型金黃地鼠的心肌保護作用

鐘意 劉剛 馬國平 丁寶珠 李曉霞 劉皓瑩 梁文杰

關鍵詞養心定悸膠囊;糖尿病心肌病;NLRP3/caspase-1/GSDMD信號通路;心肌細胞

隨著糖尿病發病率的升高，心血管并發癥已成為糖尿病患者高死亡率的主要原因。糖尿病心肌病（diabeticcardiomyopathy，DCM）是糖尿病特異性心臟并發癥，主要表現為心絞痛、心律失常、充血性心力衰竭，可獨立于冠狀動脈疾病、高血壓或瓣膜性心臟病發生[1]。炎癥損傷、氧化應激、纖維化等是DCM的重要發病機制，而細胞焦亡是一種炎癥性的細胞死亡方式，可介導心肌組織炎癥損傷，進而加速病程進展[2 - 3]。核轉錄因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）是調節炎癥過程的關鍵因子，可以激活核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體，并誘導細胞焦亡，從而釋放炎癥因子[4-5]。養心定悸膠囊是由炙甘草湯化裁而來，具有益氣滋陰、通陽復脈之功效，臨床用于治療心動悸、脈結代等癥，但其作用機制尚不明確。有研究顯示，養心定悸膠囊能有效提高緩慢性心律失常患者的心率，改善心悸、胸悶、乏力等臨床癥狀，改善血脂代謝水平和動脈血液循環，增強心肌供血，降低心血管事件的發生率和病死率[6]。實驗研究表明，養心定悸膠囊可通過提高血清超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽水平，降低白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α等水平，抑制心肌組織氧化應激和炎癥反應，從而改善異丙腎上腺素誘導的大鼠缺血性心律失常[7]。同時，養心定悸膠囊可有效改善心臟缺血再灌注損傷模型大鼠的血流動力學及心律失常，含藥血清還可有效提高大鼠心肌細胞活力[8]。本研究以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導金黃地鼠建立DCM模型，觀察焦亡通路分子在DCM模型金黃地鼠心肌組織中的表達，并探討養心定悸膠囊對心肌細胞的保護作用機制，以期為DCM的臨床治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

DP72CCD型BX53 顯微鏡購自日本Olympus 公司;Vevo2100型超聲儀購自加拿大Visual Sonics公司;PowerPac 型電泳儀、Mini Protean 型電泳槽、Trans-Blot 型半干轉膜儀、CFX96 實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀均購自美國Bio-Rad 公司;EVOS FL Auto2 型全自動活細胞顯微成像分析系統購自美國Thermo Fisher Scientific公司;Odyssey SA 型近紅外雙色激光掃描儀購自美國LI-COR公司。

1.2 主要藥物與試劑

STZ、二甲苯（批號分別為V900890、534056）購自美國Sigma 公司;養心定悸膠囊（批號06717101141，規格0.5 g/粒）購自河北永豐藥業有限公司;恩格列凈片劑（批號J20171073，規格10 mg）購自德國BoehringerIngelheim 公司;兔SP試劑盒（批號SP-9001）購自北京中杉金橋生物技術有限公司;檸檬酸鈉緩沖液（批號C1013）購自北京索萊寶科技有限公司;兔NF-κB抗體、兔β-肌動蛋白（β-actin）抗體、TUNEL 檢測試劑盒（批號分別為10745-1-AP、20536-1-AP、PF-00006）購自美國Proteintech 公司;兔NLRP3 抗體（批號NBP2-12446）購自美國Novus Biologicals 公司;兔天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）抗體（批號GB11383）購自武漢賽維爾生物科技有限公司;兔IL-1β抗體、兔消皮素D（gasdermin D，GSDMD）抗體（批號分別為ab283818、ab219800）購自英國Abcam 公司;生物素標記的羊抗兔IgG 二抗（批號D00804-07）購自美國LI-COR 公司;總膽固醇（total cholesterol，TC）檢測試劑盒（批號A111-1-1）購自南京建成生物工程研究所有限公司;IL-1β、轉化生長因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）酶聯免疫吸附檢測試劑盒（批號分別為SXR026、SXR059）購自上海森雄科技實業有限公司;肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase MB，CK-MB）試劑盒（批號K030）購自長春匯力生物技術有限公司;RNA提取試劑盒（批號LS1040）購自生工生物工程（上海）股份有限公司;高糖高脂飼料（10%豬油+20%蔗糖+2.5%膽固醇+0.5%膽酸鈉+67%基礎飼料）購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.3 實驗動物

SPF 級健康雄性5 周齡金黃地鼠50 只，體質量（100±20）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號為SCXK（京）2016-0011。實驗動物飼養于河北中醫學院肝腎病重點實驗室，自由飲食。飼養環境通風良好，12 h 晝夜節律，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

金黃地鼠適應性飼養1 周后，使用Excel 軟件生成的隨機數字將50 只金黃地鼠分為對照組（10 只）和造模組（40 只）。對照組金黃地鼠全程給予正常飼料喂養，造模組金黃地鼠全程給予高糖高脂飼料喂養[9]。飼養6 周后，造模組金黃地鼠連續3 d 腹腔注射STZ（溶于pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液中）30 mg/kg，對照組金黃地鼠腹腔注射相同體積的檸檬酸鈉緩沖液。STZ 注射3 d 后，通過尾靜脈采血檢測金黃地鼠的血糖，血糖>16.7 mmol/L視為成功誘導糖尿病，繼續飼養4 周使其自然發展為DCM[10]。將造模成功的34 只DCM模型金黃地鼠隨機分為模型組（9 只）、中藥高劑量組（8 只）、中藥低劑量組（8 只）、恩格列凈組（9 只，陽性對照）。對照組和模型組金黃地鼠灌胃生理鹽水。參照文獻[7，11]，中藥高劑量組金黃地鼠灌胃養心定悸膠囊2 g/（kg·d），中藥低劑量組金黃地鼠灌胃養心定悸膠囊1 g/（kg·d），恩格列凈組金黃地鼠灌胃恩格列凈10 mg/（kg·d），藥物均溶解于0.9% NaCl 溶液中。所有金黃地鼠每日灌胃1 次，連續灌胃8 周。

2.2 取材與處理

金黃地鼠灌胃8 周后，取尾部血用于后續實驗。然后，禁食不禁水12 h，金黃地鼠吸入異氟烷麻醉，并進行股動脈取血，以4 000 r/min 于-4 ℃離心10 min 分離血清，置于-80 ℃冰箱以備后續實驗。同時迅速取出金黃地鼠心臟并用冰生理鹽水沖洗，排出殘余血液并分離周圍組織。將心臟沿縱軸切割分離，一部分心肌組織放入中性甲醛中固定以備病理形態觀察，另一部分心肌組織放入-80 ℃冰箱保存以備Western blot及PCR檢測。

2.3 一般情況觀察

實驗期間，觀察金黃地鼠的飲食、飲水、尿量、毛發等變化，記錄金黃地鼠死亡情況。

2.4 血糖、血脂及心肌酶檢測

取“2.2”項下金黃地鼠尾部血0.1 mL，使用血糖儀檢測血糖。取“2.2”項下血清20 μL，嚴格按照試劑盒說明書要求檢測血脂TC水平和心肌酶CK-MB水平。

2.5 左室射血分數、短軸縮短率檢測

金黃地鼠吸入異氟烷麻醉后，應用超聲儀獲取左室長軸二維超聲圖像，計算左室射血分數（ejection fraction，EF）和短軸縮短率（fractional shortening，FS）。EF（%）=心臟每搏輸出量/舒張末期心室容積×100%，FS（%）=（左心室舒張末期內徑-左心室收縮末期內徑）/左心室舒張末期內徑×100%。

2.6 心肌組織病理形態觀察

取“2.2”項下中性甲醛中的心肌組織進行常規脫水、固定、石蠟包埋、切片，分別采用蘇木精-伊紅（HE）染色、Masson染色，于顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態變化并拍照。

2.7 血清炎癥因子檢測

采用酶聯免疫吸附試驗檢測。取“2.2”項下血清20μL，嚴格按照試劑盒說明書要求檢測IL-1 β、TGF-β 1水平。

2.8 心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κ B、IL-1β mRNA表達水平檢測

采用PCR法檢測。稱取“2.2”項下心肌組織50 mg，經液氮研磨后，加入RNA 裂解液、無水乙醇，以10 000r/min 于4 ℃離心10 min;加入現配制的DNA酶孵育液50 μL，室溫靜置15 min，加入RNA洗液600 μL，以10 000r/min 室溫離心1 min。逆轉錄采用兩步法反應程序，預變性95 ℃ 10 min，44 個循環反應：95 ℃ 15 s，60 ℃60 s。擴增完畢后，得到各樣本各目的基因及內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的量化周期（quantificationcycle，Cq）值，ΔCq=目的基因Cq值-內參Cq值;定量（quantification，Q）=2-ΔCq，得到每個目的基因的Q值及Q均值，各目的基因表達的相對定量（RQ）值=每個目的基因的Q 值/Q 均值;將RQ 值用于統計分析，得到mRNA表達水平。PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR引物序列及產物長度見表1。

2.9 心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κ B、IL-1β蛋白陽性表達觀察

采用SABC 法，使用兔SP 試劑盒檢測。取“2.6”項下石蠟包埋的心肌組織，切成5 μm的薄片，置于載玻片上，烤片2 h，依次加入二甲苯30 min、無水乙醇10 min、95%乙醇5 min、80%乙醇5 min 進行脫蠟復水，將石蠟切片與NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1 β一抗（稀釋度均為1 ∶100）于4 ℃孵育12 h，使用羊抗兔IgG聚合物于37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精染色，封片，于顯微鏡下觀察并拍照。細胞呈現淡黃或黃褐色顆粒表示目的蛋白呈陽性表達。

2.10 心肌組織GSDMD蛋白表達水平檢測

采用Western blot 法檢測。稱取“2.2”項下心肌組織50 mg，提取總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后將印記轉至PVDF膜上，使用快速封閉液封閉后，將膜與GSDMD、內參β-actin 一抗（稀釋度分別為1 ∶500、1 ∶1 000）于4 ℃孵育12 h，然后與羊抗兔IgG 二抗（稀釋度為1 ∶5 000）于37 ℃孵育1 h，顯影，拍照。采用Image J 軟件計算，以目標蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值表示目標蛋白的表達水平。

2.11 心肌細胞DNA損傷檢測

使用TUNEL檢測試劑盒進行檢測。取“2.6”項下石蠟包埋的心肌組織，切成5 μm的薄片，二甲苯浸泡2 次，每次30 min，然后浸泡于不同濃度的乙醇（100%、95%、80%）中，每次5 min。蛋白酶K孵育組織20 min，平衡緩沖液孵育5 min，TUNEL反應緩沖液孵育2 h，使用含DAPI的封片劑封片，于顯微鏡下觀察并拍照。明亮的綠色熒光表示細胞DNA損傷，為陽性細胞;藍色熒光表示細胞核。

2.12 統計學方法

使用Orign 2019 軟件對數據進行統計分析。計量資料以x±s 表示，各組數據比較前先進行正態性及方差齊性檢驗，滿足正態性且方差齊性者，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 各組金黃地鼠一般情況觀察結果

對照組金黃地鼠一般情況良好，飲食、飲水及尿量均正常，毛發整齊有光澤。模型組金黃地鼠精神萎靡，動作遲緩懶動，毛色晦暗無光澤，飲食和飲水量增加，多尿并伴有腥臭味。恩格列凈組及中藥低、高劑量組金黃地鼠上述癥狀較模型組均有不同程度改善。除對照組外，40 只金黃地鼠注射STZ后，造模成功的DCM模型金黃地鼠有34 只，成模率為85.00%。進行灌胃后，模型組、恩格列凈組和中藥低、高劑量組因感染、糖尿病并發癥等原因，每組各死亡1只，總死亡率為11.76%（4/34）。

3.2 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠血糖、血脂及心肌酶的影響

與對照組比較，模型組金黃地鼠血糖、TC、CK-MB水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，恩格列凈組金黃地鼠血糖水平顯著降低（P<0.05），中藥高劑量組和恩格列凈組CK-MB 水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。結果見圖1。

3.3 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠EF、FS的影響

與對照組比較，模型組金黃地鼠EF、FS 均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，中藥低、高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠EF、FS均顯著升高（P<0.01）。結果見圖2。

3.4 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠心肌組織病理形態的影響

HE 染色結果顯示，對照組金黃地鼠心肌細胞結構清晰、排列整齊、層次鮮明，核圓形或橢圓形，染色質分布均勻，心肌間隙清晰可見。模型組金黃地鼠心肌細胞結構不清、排列雜亂，組織腫脹，胞體增大且大小不均，細胞核呈長桿狀。中藥低、高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠心肌細胞間隙清晰，細胞排列整齊，細胞核形態正常，染色質分布均勻，尤其中藥高劑量組和恩格列凈組改善較明顯。結果見圖3。

Masson染色結果顯示，對照組金黃地鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞結構清晰，細胞核大小均一，膠原纖維著色淡。模型組金黃地鼠心肌纖維排列紊亂、稀疏，心肌細胞肥大變性，細胞核大小不一，心肌間藍染的膠原纖維增多。中藥低、高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠心肌細胞肥大及纖維排列紊亂得到改善，心肌間藍染的膠原纖維較少;但中藥低劑量組金黃地鼠心肌間藍染的膠原纖維仍有較多沉積，組織分布較紊亂。結果見圖3。

3.5 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠血清炎癥因子的影響

與對照組比較，模型組金黃地鼠血清IL-1β、TGF-β1水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組、恩格列凈組金黃地鼠血清IL-1β、TGF-β1 水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。結果見圖4。

3.6 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠心肌組織相關因子mRNA表達水平的影響

與對照組比較，模型組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β mRNA表達水平均顯著升高（P<0.05 或P<0.01）。與模型組比較，中藥高劑量組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β mRNA，中藥低劑量組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB mRNA 及恩格列凈組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、NF-κB mRNA表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。結果見表2。

3.7 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠心肌組織相關蛋白陽性表達的影響

顯微鏡觀察結果顯示，與對照組比較，模型組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β蛋白陽性表達均明顯增多，NF-κB主要表達在細胞核，其余蛋白主要表達在細胞質。與模型組比較，中藥高劑量組、恩格列凈組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β蛋白和中藥低劑量組金黃地鼠心肌組織NF-κB、IL-1β蛋白陽性表達均明顯減少;中藥低劑量組金黃地鼠心肌組織NLRP3、caspase-1、GSDMD蛋白陽性表達均略有減少。結果見圖5。

3.8 養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠心肌組織GSDMD蛋白表達水平的影響

與對照組比較，模型組金黃地鼠心肌組織GSDMD蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，中藥低、高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠心肌組織GSDMD蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05 或P<0.01）。結果見圖6。

3.9 養心定悸膠囊對DCM 模型金黃地鼠心肌組織DNA損傷的影響

TUNEL 染色結果顯示，對照組金黃地鼠心肌組織僅見少量DNA損傷陽性細胞。與對照組比較，模型組金黃地鼠心肌組織DNA損傷陽性細胞明顯增加。與模型組比較，中藥低、高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠心肌組織DNA損傷陽性細胞均有不同程度減少。結果見圖7。

4 討論

DCM的發病機制尚未完全闡明，目前公認的發病機制包括炎癥、高血糖、蛋白非酶糖基化、氧化應激、鈣離子轉運異常等，其中炎癥是導致左心室功能障礙的獨立危險因素，而細胞焦亡是一種伴隨顯著炎癥反應的程序性細胞死亡方式[3，12]。養心定悸膠囊由炙甘草湯化裁而來，炙甘草湯源自漢代張仲景《傷寒論》，由炙甘草、生地黃、麥冬、紅參、阿膠、黑芝麻、大棗、桂枝、生姜組成，具有益氣滋陰、通陽復脈之功效[7]。方中人參皂苷Rb1[13]、人參皂苷Rg1[14]、甘草酸[15]等有效成分具有改善DCM的功效。恩格列凈是一種鈉-葡萄糖協同轉運蛋白2 抑制劑，可有效控制2 型糖尿病患者的血糖水平，并可顯著降低心血管不良事件和低血糖的發生風險[16 - 17]。因此，本文選擇其作為陽性對照。

本研究結果表明，養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠心肌組織具有保護作用。DCM常表現為心肌收縮功能障礙，而EF和FS是DCM左心室收縮功能障礙的重要指標[18]。本研究以脂質代謝和人類更為接近的金黃地鼠為實驗對象，結果顯示，養心定悸膠囊能降低DCM模型金黃地鼠的EF 和FS，表明養心定悸膠囊可改善其心肌收縮功能障礙。心肌組織病理觀察結果顯示，DCM模型金黃地鼠出現心肌細胞排列雜亂、心肌間藍染的膠原纖維增多等組織病理形態;養心定悸膠囊灌胃8 周后，金黃地鼠心肌間隙清晰，細胞排列整齊，細胞核形態正常，心肌間藍染的膠原纖維有所減少，纖維排列紊亂得到改善。研究表明，CK-MB主要存在于心肌細胞中，是診斷心肌細胞損傷靈敏而特異的酶學指標，在DCM模型金黃地鼠心肌細胞中表達升高[19]。本研究結果顯示，DCM模型金黃地鼠CK-MB水平升高，說明存在心肌細胞損傷，而養心定悸膠囊可降低DCM模型金黃地鼠血清中的CK-MB水平，減輕心肌細胞損傷。同時，本實驗研究顯示，給予養心定悸膠囊后，DCM模型金黃地鼠血糖有降低趨勢，可能是由于養心定悸膠囊中地黃活性成分梓醇[20]和人參活性成分人參皂苷Rg3[21]的作用。本研究結果顯示，養心定悸膠囊對DCM模型金黃地鼠血脂水平（TC）并無影響。

心肌組織炎癥損傷與DCM的發展有關，在炎癥過程中，心肌細胞和炎癥細胞分泌刺激纖維化的細胞因子，可導致心臟肥大、纖維化和功能障礙[22]。研究表明，在焦亡細胞中，NLRP3 炎癥小體激活后，可促進促炎因子IL-1β釋放到細胞外，加劇炎癥損傷[23]，并誘導心肌肥厚和功能障礙[24]。TGF-β1 是心肌纖維化和心肌肥大發生發展密切相關的炎癥細胞因子之一，通過降低TGF-β1的表達可有效改善心肌纖維化狀態[25]。本研究結果顯示，模型組金黃地鼠血清中的TGF-β1、IL-1β水平均顯著升高，心肌組織IL-1β表達上調，加劇了心肌組織病理改變;而中藥高劑量組和恩格列凈組金黃地鼠血清中的TGF-β1、IL-1β水平均顯著降低，心肌組織IL-1β表達下調，表明養心定悸膠囊可抑制IL-1β、TGF-β1 的產生，減輕心肌組織炎癥損傷，進而改善心肌纖維化。

有研究顯示，DCM模型大鼠表現出嚴重的炎癥反應、心肌纖維化、細胞死亡、超微結構紊亂，并發現焦亡相關分子NLRP3、caspase-1 和IL-1β過度表達;通過抑制NLRP3 炎癥小體的活化，可減輕細胞焦亡及炎癥損傷，改善DCM模型大鼠心肌組織的形態結構和纖維化程度[5，26]。同時，有研究發現，高表達線粒體乙醛脫氫酶2可通過降低活性氧的產生來抑制NLRP3 炎癥小體活化及細胞焦亡，從而減輕高糖誘導的H9C2 心肌細胞損傷所致的毒性反應，并增強細胞活性[27]。本研究結果顯示，模型組金黃地鼠心肌組織中的NLRP3、caspase-1、GSDMD、NF-κB、IL-1β mRNA及蛋白表達均上調，提示NLRP3/caspase-1/GSDMD 信號通路活化，導致細胞焦亡，加重心肌組織炎癥損傷。而養心定悸膠囊干預后，可以下調以上指標的表達，抑制NLRP3 炎癥小體活化，同時減輕心肌細胞DNA損傷，從而抑制心肌組織細胞焦亡，減輕炎癥損傷，發揮對心肌細胞的保護作用。

綜上所述，DCM 模型金黃地鼠心肌組織NLRP3/caspase-1/GSDMD信號通路表達增強，養心定悸膠囊可通過調控該信號通路抑制DCM模型金黃地鼠心肌細胞焦亡，減輕DCM炎癥損傷，從而保護心肌細胞。然而，中醫藥作用具有多途徑、多靶點的特點，養心定悸膠囊作為一種中成藥，含9 味中藥，有效成分復雜，未來將進一步研究其有效成分，并進行離體實驗驗證，為臨床用藥提供更多的實驗依據。