長期不同施肥下褐土養分及酶活性的生態化學計量特征

陳浩寧，周懷平，文永莉，向 云，程 曼*

（1 山西大學黃土高原研究所，山西太原 030006；2 山西農業大學資源環境學院，山西晉中 030031）

生態化學計量學通過將生態計量和化學計量原理相結合，綜合考慮自然選擇、資源配置和消費者驅動營養物質循環理論等[1–2]，研究物質和能量在生態系統內生物和環境因子的相互作用下是如何保持平衡的。生態計量學常與生態系統的功能過程和生物行為相聯系[3]，生物可以通過自身化學計量特征、群落結構、生態酶活性等方面的改變，以響應變化的底物計量特征[4]。生態酶研究主要集中在與有機質水解有關的 β-1, 4-葡萄糖苷酶 (β-1, 4-glucosidase, BG)、β-1, 4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 (β-1, 4-N-acetylglucosidase, NAG)、亮氨酸氨基肽酶 (leucine aminopeptidase,LAP)、堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)等。土壤系統中水解酶活性及比值常與養分濃度或元素化學計量相聯系，可作為反映微生物群落代謝活動對養分需求及養分有效性之間的生物地球化學平衡指標[5–6]。Allison等[7]深入研究調控土壤水解酶生產的環境因子，提出“進化經濟原則”。Sinsabaugh等[8]提出生物地球化學平衡模型，探討環境養分的有效性、酶活性和微生物生長效率之間的關系，指出在全球尺度上酶化學計量比BG∶(NAG+LAP)為1.41，BG∶ALP 為 0.62，(NAG+LAP) ∶ALP 為0.44[9]。Tian等[10]對土壤元素化學計量的研究表明，我國土壤C∶N、C∶P、N∶P平均為11.9、136和9.3。孫騫等[11]研究發現黃土高原旱作農耕區土壤C∶N、C∶P、N∶P平均為5.52、15.56和2.79。

內穩性是生態化學計量學存在的前提[12]，即當土壤中可利用資源的計量比發生變化時，微生物可以通過改變生態酶計量比從有機質中獲取資源來維持自身生物量比的穩定[13]。“資源分配理論”指出，微生物會將更多的能量和養分分配于獲取限制性資源酶的生產[14]，因此，土壤酶活性及酶計量比可作為反映微生物代謝受能量和養分限制程度的敏感指標。在農田系統中，對土壤養分和生態酶活性關系的研究主要是通過長期肥料單施或混施調節底物有效性實現。由于不同施肥處理養分投入比和種類的差異，使C、N和P在生態系統內部生物和環境之間循環的不確定性增加，會影響微生物群落結構和酶活性表達，從而改變農田生態系統的結構與功能[15–16]。目前關于長期施肥對農田生態系統影響的研究主要集中于土壤肥力、微生物群落組成和土壤酶活性等方面，也有一些關于農田的元素計量范圍的研究[17–19]。而將元素計量與酶計量結合，可從微生物資源限制角度探討褐土農田元素循環的生物地球化學特征。依托山西壽陽旱地農田生態系統野外科學觀測研究站，借助生態化學計量學手段，研究褐土元素和酶活性生態化學計量對長期不同施肥處理的響應特征，探討長期不同施肥土壤養分的限制性及酶活性表達的反饋機制，為進一步調控褐土碳、氮、磷元素平衡，改善農田土壤肥力和實現可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗站位于山西省壽陽縣宗艾鎮(37°58′N，113°06′E)，海拔 1130 m，土壤類型為褐土，成土母質為馬蘭黃土，土層深厚。年平均氣溫7.4℃，無霜期約130天，年平均降雨量501 mm，年際間變化較大，干燥指數1.3，屬于半濕潤偏旱區。長期定位試驗布設前(1992年)耕層土壤(0—20 cm)基本化學性質為有機碳13.81 g/kg、全氮1.05 g/kg、全磷0.76 g/kg、全鉀 14.10 g/kg、有效氮 118 mg/kg、有效磷4.84 mg/kg、pH 8.4。

1.2 試驗設計

長期定位施肥試驗開始于1992年，試驗布設參考徐明崗等編著的《中國農田土壤肥力長期試驗網絡》[20]。采用氮、磷、有機肥三因素四水平正交法設計施肥小區，共18個處理，隨機排列，無重復，各小區面積為66.7 m2。試驗用氮肥為尿素(N 46%)，磷肥為過磷酸鈣(P2O514%)，有機肥為新鮮牛糞(有機質 90.5～127.3 g/kg、全氮 3.39～4.97 g/kg、全磷1.37～1.46 g/kg、全鉀 14.1～34.3 g/kg)，每年秋季玉米收獲后結合耕翻一次性施入。本研究選取其中9個處理，即無施肥對照處理(CK)；4個氮磷化肥處理 N1P1、N2P2、N3P3和 N4P4；4個有機肥處理N2P1M1、N3P2M3、N4P2M2和 M6。各處理施肥量見表1。

表1 1992—2016年各處理年均施肥量(kg/hm2)Table 1 Annual fertilizer input in each treatment from 1992 to 2016

1.3 樣品采集與測定

分別于1992年播種前和各施肥處理2001、2006、2016年秋季玉米收獲后采集0—20 cm土層土壤樣品，各施肥小區按“S” 形5點采樣混合形成一個土樣，去除土樣中可見植物殘體及石塊，將土樣分成兩份，一份在自然條件下風干后過2 mm篩測定土壤化學性質，另一份過1 mm篩后保存在4℃冰箱內用于測定土壤酶活性。

土壤基礎化學性質測定參考《土壤農化分析》[21]。采用微孔板熒光法[22]測定土壤BG、NAG和ALP活性，底物分別為4-MUB-β-glucopyranoside、4-MUBN-acetyl-β-D-glucosaminide 和 4-MUB-phosphate，MUB可以在365 nm波長激發，在450 nm處檢測到熒光[23]，通過土壤酶水解反應將其釋放，檢測熒光量來表征土壤酶活性。酶活性計算參考DeForest[23]的方法，單位為nmol/(g·h)，并將酶活性值通過log對數變換以滿足正態分布。

1.4 數據分析

所有試驗數據用 Microsoft Excel 2019 整理，Origin 2018作圖。不同施肥處理土壤生態酶活性及化學計量比之間顯著性差異通過SPSS 19.0單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD實現，土壤元素、酶活性及化學計量比之間的相關性采用Pearson相關分析研究，通過逐步回歸進一步分析土壤元素與酶活性之間的關系。

本研究中土壤有機碳、全氮和全磷之間的比值分別以C∶TN、C∶TP、TN∶TP表示，考慮到施肥對農田土壤養分資源的影響，故計算有機碳與有效養分之間的計量比C∶AN、C∶AP、AN∶AP。由于有機碳與有效養分之間的比值差異過大，故對其進行對數變換，將AN∶AP值擴大10倍以避免變換產生負值。土壤酶計量比通過lnBG/lnNAG、lnBG/lnALP和lnNAG/lnALP計算得出。向量角度 (vector angle)>45°越大表示微生物受磷限制越強，向量長度(vector length)越長表示微生物受碳限制越嚴重。向量角度 (vector angle) 和向量長度 (vector length) 通過公式 (1)和公式 (2)計算[24]：

2 結果與分析

2.1 長期不同施肥下土壤養分化學計量比變化特征

表2顯示，與試驗初期(1992年，數據見1.1部分)相比，高量有機肥處理(M6)土壤有機碳含量的年增長速率最快，為0.36 g/(kg·a)，說明高量有機肥投入可以促進土壤有機碳固存。2001—2016 年，與CK、單施化肥處理相比，化肥配施有機肥處理土壤全氮和有效氮含量無明顯變化，高量有機肥處理土壤全氮和有效氮含量明顯提高，這表明旱作玉米中氮磷化肥處理基本可以維持土壤氮庫穩定，有機肥的投入則可促進土壤氮庫和有效氮累積。整體上，土壤全磷含量隨化肥和有機肥投入量增加而增加。與試驗初期相比，連續施肥24年后高量有機肥處理土壤有效磷年增長速率為8.78 mg/(kg·a)，顯著高于CK和化肥處理，這表明長期施肥處理有利于提高土壤全磷和有效磷含量，有機肥處理的提高效果更優(表2)。

表2 長期不同施肥下土壤有機碳及全量和有效態氮、磷含量Table 2 The contents of organic C, and total and available N and P in soils under different long-term fertilization treatments

圖1A顯示，土壤C : TN在各化肥和CK處理之間不存在顯著差異，有機肥處理以N2P1M1、N3P2M3和M6處理土壤C: TN較CK處理顯著降低了23.1%～30.2% (P<0.05)。圖1B和C顯示，土壤C∶TP和TN∶TP比均隨化肥投入量增加而降低。其中，在N4P4處理土壤C∶TP較CK處理顯著降低了23.3%(P<0.05)，TN∶TP降低了17.6% (P>0.05)；同時4個化肥處理和4個有機肥處理之間土壤C∶TP均不存在顯著差異，而土壤TN∶TP在M6處理顯著高于其他各處理 (P<0.05)。圖1D顯示，土壤C∶AN的變化范圍為2.11～2.29 (均值)，各處理之間彼此不存在顯著差異。圖1E和F顯示，土壤C∶AP和AN∶AP隨化肥和有機肥投入量增加而降低，且4個有機肥處理土壤C∶AP和AN∶AP較4個化肥處理降低的幅度更大。綜上表明，長期定位施肥試驗顯著改變了褐土農田土壤元素庫結構，其中化肥處理土壤全磷相對提升更顯著，而有機肥在對土壤有效養分的改善作用上明顯優于單施化肥，并隨投入量增加土壤C∶AP和AN∶AP顯著降低。

圖1 長期不同施肥處理土壤元素計量比變化特征Fig.1 Characteristics of stoichiometric ratios of soil elements under different long-term fertilization treatments

2.2 長期不同施肥下土壤酶活性及化學計量比變化特征

2.2.1 土壤酶活性特征 圖2中，長期不同施肥處理土壤 BG 活性為 2.47～4.28 nmol/(g·h)。CK 和單施化肥4個處理BG活性隨施肥年限增加而降低。經過24年褐土長期施肥后，M6處理BG活性為4.17 nmol/(g·h)，顯著高于其他處理。土壤NAG和ALP活性分別為 0.65～2.95 和 1.27～3.10 nmol/(g·h)，除N1P1處理外，CK和其他化肥處理NAG和ALP活性在年限的變化上均以2016年最低。24年長期試驗后，M6處理土壤NAG活性顯著高于其他各施肥處理，ALP活性以N1P1和M6處理顯著高于CK處理。雙因素方差分析發現，施肥年限、肥料化學性質與投入配比、年限與肥料之間的交互作用是影響褐土土壤酶活性的關鍵因子。綜上說明長期施用大量氮磷化肥會抑制土壤酶活性，有機肥施用可以起到改善作用。

圖2 長期不同施肥下土壤酶活性變化特征Fig.2 Changes of soil eco-enzymatic activities under different long-term fertilization treatments

2.2.2 土壤酶活性化學計量比特征 圖3中，N2P2、N3P3和N4P4化肥處理土壤酶計量比lnBG/lnANG略高于有機肥處理，lnNAG/lnALP略低于有機肥處理，但各處理彼此間不存在顯著差異(P>0.05)。通過與1992年 (試驗開始年) 酶計量值比較，發現施肥試驗后本研究區土壤lnBG/lnNAG較1992年整體升高了37.3%～116.7%，lnNAG/lnALP降低了32.0%～53.1%。

由長期不同施肥處理土壤酶化學計量向量角度和向量長度(圖4)可知，相比于1992年，各施肥處理下向量角度均＞45°，向量長度增加了11.1%～52.4%，長期定位試驗加劇了褐土中微生物代謝的磷和碳限制。長期定位試驗向量角度和向量長度在各處理彼此間不存在顯著差異 (P>0.05)。其中，化肥施用以N1P1(低量) 處理下向量角度和長度最低，有機肥施用以 M6處理最低，而 N2P2、N3P3和 N4P4處理向量角度和長度均高于各有機肥處理。以上說明，相比大量單施化肥，低量施用下土壤微生物代謝的磷和碳限制程度較弱，同時有機肥處理特別是高量有機肥可以有效緩解微生物的磷和碳限制。

2.3 土壤元素及其計量比與酶活性及其計量比之間的相關性分析

由表3可知，有機碳(C)、全磷 (TP) 及有效磷(AP) 與酶活性及化學計量比之間均不存在顯著相關關系，全氮(TN) 與BG、NAG和lnNAG/lnALP之間存在顯著正相關關系，有效氮(AN)與BG、NAG和ALP酶、lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP呈顯著或極顯著的相關關系。從生態化學計量角度看，C∶TN和C∶AN與lnBG/lnNAG之間存在極顯著正相關，C∶TP和C∶AP與lnBG/lnALP之間相關關系未達到顯著水平，TN∶TP與lnNAG/lnALP之間存在顯著正相關，AN∶AP與lnNAG/lnALP之間不存在顯著相關關系。

表3 土壤養分含量及其計量比與酶活性及其計量比之間的相關系數(r)Table 3 The correlation coefficient between soil nutrient contents and their stoichiometric ratios and enzyme activities and their stoichiometric ratios (r)

進一步逐步回歸發現，AN分別解釋了BG 36.6%、NAG 42.7%、ALP 14.9% 和 lnNAG/lnALP 41.9% 的變異，AN和TP共同解釋了lnBG/lnNAG 43.4%的變異了(表4)，說明有效氮在調節褐土農田土壤酶活性及化學計量比上發揮著關鍵作用。

表4 酶活性及計量比與土壤養分的逐步回歸分析Table 4 Stepwise regression of soil enzyme activities and their stoichiometric ratios and soil nutrients

3 討論

3.1 土壤元素化學計量特征對長期不同施肥的響應

土壤C∶TN作為預測有機質分解作用和碳氮飽和診斷指標，影響著碳氮循環過程[25]，土壤C∶TN的高低與有機質的分解速率成反比[2]。長期24年施肥試驗土壤C∶TN為12.86 (均值)，高于中國土壤平均值 (11.9)[10]，符合耕層土壤有機質碳氮比變化范圍(8∶1～15∶1)[2]，褐土有機質礦化速率表現出相對緩慢的特點[26]。有機肥投入下土壤C∶TN (11.29，均值)顯著低于CK處理 (14.54，均值)，說明有機肥施用可以加速土壤有機質分解。這是因為有機肥施用后有效緩解了微生物碳限制 (圖4B)，促進了微生物生長繁殖，顯著提高的生物量 (較CK處理提高50%～76%[27–28])刺激其對有機質礦化的強度和土壤可溶性有機碳的消耗。

一般認為，土壤C∶TP可以反映微生物礦化有機質過程中磷素的釋放與固持之間的平衡[26]，較低的碳磷比意味著微生物分解有機質釋放有效磷的潛力較大，本區域土壤C∶TP為16.28 (均值)，顯著低于中國土壤的136[10]。楊振興等[29]研究發現，長期施用化肥主要增加了HCl-P和Residual-P兩種形態磷，而在褐土中這兩者都是極易被固定的類型。本區域土壤C∶TP隨化肥投入量增加而降低，高量化肥處理(N4P4) 顯著低于CK處理，說明長期單施化肥會降低土壤磷素利用率，易形成難溶的穩定態磷而大量固存于土壤，這與王傳杰等[17]的研究結果相似，圖4A中不斷增加的磷限制也證明了此觀點。

土壤TN∶TP常用來確定土壤養分的限制因子和限制閾值[2, 26]。本研究中土壤 TN∶TP 為 1.31 (均值)，顯著低于中國土壤9.3[10]，說明本區域磷素含量相對豐富。土壤TN∶TP隨化肥投入量增加而降低，N4P4(1.02) 顯著低于 N1P1(1.28) 和 N2P2(1.20) 處理，這是由于化肥處理褐土磷素容易以難溶的穩定態固定于土壤中，并隨化肥投入量增加磷庫固定越大[29]，而TN則基本保持穩定(表2)，造成土壤TN∶TP顯著降低，也表明化肥處理對土壤磷庫影響作用更大。高量有機肥處理 (M6) 土壤 TN∶TP (均值1.74) 顯著高于 CK (1.23) 和各化肥處理 (1.15)，可能是有機肥的投入促進了磷庫活化并為土壤帶來大量有機氮[30]，造成土壤TN∶TP相對升高。本研究施肥處理TN∶TP變化趨勢與前人研究結果[18–19]基本一致。對比不同施肥處理土壤C∶AP與AN∶AP之間的差異，發現土壤有效磷較有機碳和有效氮增幅更大，且有機肥在提高土壤養分有效性特別是有效磷含量上的效果更優于化肥處理。

綜上可知，長期不同定位施肥試驗顯著改變了褐土元素化學計量關系。單施化肥主要促進了磷素固持，造成土壤C∶TP和TN∶TP顯著降低；有機肥則可促進褐土有機質分解，改善養分供應的連續性，顯著提高土壤有效磷含量。

3.2 土壤酶活性化學計量特征對長期不同施肥的響應

本研究中酶化學計量C∶N∶P大致為5∶2∶3，區別于全球尺度1∶1∶1[9]，反映出長期施肥條件下褐土可利用的碳磷元素相對缺乏，整體較高的BG和ALP活性也說明微生物可以通過調控酶的表達來適應資源稀缺的土壤環境。

不同施肥處理下土壤酶計量比、向量角度和長度特征，可以反映微生物生長和代謝過程中能量和資源限制差異[13,24]。“資源分配理論”指出，土壤中資源的有效性與土壤酶的相對活性之間存在耦合關系，當環境底物充沛而有效資源稀缺時，微生物會將更多的能量 (C)和養分 (N、P)分配于獲取限制性資源酶的生產[14,31]。本研究中 N2P2、N3P3和 N4P4處理下，土壤 lnBG/lnNAG、酶向量角度和長度略高于各有機肥處理(P>0.05)，而 lnNAG/lnALP 略低于各有機肥處理 (P>0.05)，這是因為化肥處理作物產量顯著增加的同時大量消耗土壤中可溶性有機碳和有效磷[17]，且無機磷施入褐土后容易與鈣、鎂等元素結合而降低磷素的可利用性，加劇微生物代謝活動中碳和磷限制 (圖4A)，微生物在與植物競爭能量和資源的過程中會將更多的目標放在BG和ALP生產上，造成lnBG/lnNAG更高，lnNAG/lnALP更低。而有機肥的投入刺激了土壤有機質分解并大幅提高了AP含量 (圖1)，可以滿足微生物生長對能量和資源的需求，有效緩解碳和磷限制，造成BG和ALP活性相對降低，這與崔繼文等[32]研究結果基本一致。藍賢瑾等[33]在紅壤的研究結果表明，長期有機肥處理顯著提高了微生物對氮素需求，從而刺激分泌更多NAG改變了酶化學計量比，與本研究NAG活性和向量角度的變化具有相似性。

圖4 長期施肥處理下土壤酶化學計量向量角度和向量長度變化Fig.4 Vector angle and vector length of soil enzymatic stoichiometry under different long-term fertilization treatments

另一方面，本研究酶化學計量的變化可能與長期施肥引起微生物學特征改變有關。前人研究發現，BG和ALP活性相對升高與微生物群落中真菌相對富集存在顯著相關性[5,34]。真菌更高的生物量C∶N意味著對C需求更大[35]，本研究中長期化肥處理土壤相對更高的有機碳含量或許為真菌富集提供了機會，有利于BG活性相對提高，而有機肥施用則使土壤向高質方向發展 (圖1)，為好營養的細菌富集創造條件。最近，Chen等[36]研究指出，酶催化的土壤有機質分解更有可能是由編碼水解酶的微生物功能基因驅動的，功能基因相對豐度改變的影響反映在相應的酶活性上。Luo等[37]針對C∶N∶P計量平衡與土壤生態功能穩定性的關系研究發現，土壤元素含量與編碼水解酶的功能基因之間存在顯著相關性。據此我們推斷，本研究中土壤酶化學計量lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP在長期化肥和有機肥處理之間的差異，可能與肥料性質對土壤C∶N∶P和生態功能的作用程度不同有關，造成編碼水解酶的微生物功能基因豐度調整，從而引起酶活性相對改變。

綜上，土壤酶計量比和向量特征揭示，褐土施肥處理后微生物代謝整體面臨強烈的磷限制，且化肥處理易加劇微生物碳和磷限制，有機肥可緩解土壤微生物資源限制程度。本區域酶活性化學計量變化符合Allison等[7]提出的酶生產“進化經濟原則”。

3.3 土壤元素和酶活性化學計量關系研究

相關性分析和逐步回歸結果表明，有效氮對BG、NAG、ALP活性和酶化學計量lnBG/lnNAG與lnNAG/lnALP有很好的解釋作用。前人研究發現，以蛋白質為主體的水解酶合成需要足夠的氮素供應[38]；處于資源脅迫中的微生物會減少對獲取環境中非稀缺資源酶的投資[31]。除高量有機肥處理外，其他施肥處理土壤有效氮含量較1992年有不同程度的降低 (參見1.1部分)，但基本可以滿足微生物生存需求，相應的會減少NAG合成[31]；本區域微生物代謝整體受到碳、磷限制的影響，會將更多的氮素用于生產并維持相對更高的BG和ALP活性 (圖3)，造成有效氮與lnBG/lnNAG和lnNAG/lnALP之間存在極顯著相關性 (P<0.01)。以上結果表明土壤酶活性表達存在資源依賴性，有效氮在調節褐土酶活性和酶化學計量的變化上發揮著關鍵作用。

另外發現，本研究中所涉及的因子均不能很好地解釋酶計量lnBG/lnALP變異，AN∶AP與lnNAG/lnALP之間也不存在相關關系，說明本研究通過水解酶和元素計量之間的關系，來研究農田土壤微生物資源需求與元素生物地球化學循環存在一定不足。一方面，可能是環境中各種生物或非生物因子(土壤團聚體、溫度、微生物群落組成等[31])具有更強烈的間接干擾作用，影響了酶活性比與土壤元素組成間的相關性[5]，而這些因子在本研究中并未測定。另一方面，本研究的特殊性在于農田持續的外源底物供應，往往比土壤原有底物更容易被生物利用，從而擾亂了土壤中酶系統對原有底物的響應特征。

4 結論

長期不同施肥顯著改變了褐土元素的化學計量特征。施用化肥主要促進了土壤磷素固持，造成元素計量比C∶TP和TN∶TP顯著降低。施用有機肥可以促進有機質分解，提升有效磷含量，顯著降低土壤C∶AP與AN∶AP。

施肥加劇了土壤磷對微生物代謝的限制，化肥易加劇微生物碳和磷限制，有機肥可緩解土壤微生物資源限制程度。

褐土區土壤酶活性表達存在強烈的資源依賴性，有效氮在調節褐土酶活性和酶化學計量的變化上發揮著關鍵作用。