不同基質水產苗種中己烯雌酚酶聯免疫分析法的建立

梁娟　魏海英　于盟盟　張倩玉　牟丹丹　趙濤濤

摘要：為建立水產苗種中己烯雌酚（Diethylstibestrol，DES）殘留量的定性、定量檢測的酶聯免疫（ELISA）法，采用乙酸乙酯作為提取劑，超聲振蕩提取替代渦旋振蕩提取、純水對正己烷進行飽和等措施對前處理過程進行優化，同時考察了基質效應對檢測結果的影響。DES在0.150～9.00 ng·mL的加標水平范圍內，曲線相關系數R=0.997，方法定量限為0.075 μg·kg;中國對蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種、牙鲆苗種在0.075、0.150、0.750 μg·kg加標水平下，平均回收率測定范圍為74.3%～96.7%，精密度范圍為3.7%～7.6%。試驗結果表明，該法靈敏度更高、特異性強、快速簡便，適用于不同基質水產苗種中DES殘留量的定性和定量分析。

關鍵詞：水產苗種;己烯雌酚;殘留量;不同基質;酶聯免疫法

己烯雌酚（DES）是一種人工合成的雌激素，具有調節生物機體代謝、生長、發育及生殖等作用，能促進蛋白質的合成代謝，導致氨基酸合成蛋白質的速度加快而使體重增加[1]，曾被水產育苗和養殖技術人員作為提高產量的“法寶”，帶來巨大的經濟效益，在醫學上也被廣泛應用于婦科病的預防和治療[2]。DES在生態環境中降解緩慢，通過食物鏈進入人體，會誘發少兒發育早熟、生殖器病變，引起后代多種泌尿生殖系統異常[3]，甚至對人體產生致畸、致癌、致突變等危害[4]，即使排出體外也會在土壤和水源中富集，造成生態環境污染惡性循環。許多國家已明令禁止將DES用于動物養殖。早在1971年，美國就已頒布禁止使用DES的相關法令，隨后1978年歐盟也頒發相關禁止法令，2012年國際癌癥研究機構將DES列為Ⅰ類人類致癌物[5];2002年《中華人民共和國農業部公告第193號》明確將DES及代謝物列為食品動物中禁用的獸藥，2020年《中華人民共和國農業農村部公告 第250號》也明確規定，DES及其鹽和酯在所有動物源性食品中不得檢出。但由于缺乏科學管理和經濟利益的驅使，DES的違規使用現象屢禁不止。

在水產品質量安全監督工作中，大型儀器分析方法靈敏度高、準確性好，常作為藥物殘留檢測的確認方法。然而，水產苗種的繁育季節性強、周期短，抽檢樣品用大型精密儀器進行檢測，由于檢測技術復雜、前處理過程耗時長、檢測結果滯后等原因，陽性樣品檢測結果上報給漁業主管部門時，苗種已被銷售，不但貽誤最佳執法時機，而且容易使陽性苗種流向養殖環節，從源頭上造成水產品質量安全的隱患。因此，在水產苗種的實際檢測工作中，建立靈敏度高、特異性強、快速簡便、健康安全的方法，為漁業質量安全主管部門的管理工作提供及時的技術支撐，提高執法工作的實效性具有非常重要的現實意義。

目前DES的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[3]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[6]、氣相色譜-串聯質譜法（GC-MS/MS）[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8-9]、液相色譜—質譜聯用法（LC-MS/MS）[10]、高效液相色譜—串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[11]、超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）[12]、液相色譜-高分辨質譜法（LC-HRMS）[13]等大型精密儀器分析法，ELISA法測定水產品及動物性食品中DES殘留量也有SC/T 3020-2004《水產品中己烯雌酚殘留量的測定 酶聯免疫法》[14]和農業部1163號公告-1-2009《動物性食品中己烯雌酚殘留檢測酶聯免疫吸附測定》[15]等相應的標準。近幾年來，DES的分析檢測方法在不斷地完善，進一步優化預處理技術，提高儀器靈敏度，建立更高效、更安全、更環保和更便捷的ELISA檢測方法是發展的趨勢[16]，也是食品安全檢測領域中最具有發展前景和產業化的檢測技術[17]。本文對美國柏爾生物技術公司提供的試劑盒使用方法采用超聲振蕩提取替代渦旋振蕩提取、純水對正己烷進行飽和等優化改進措施，以期建立對不同基質水產苗種中DES殘留量進行定性、定量測定的ELISA分析方法，為漁業質量安全主管部門的監管工作提供及時、準確的技術保障。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

MK3微孔板酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];微量移液器、多道微量移液器（賽默飛世爾科技有限公司）;PL202-L電子精密天平（梅特勒托利多儀器上海有限公司）;KQ-5200DE超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）;DC-24水浴氮吹儀（上海安譜實驗科技股份有限公司）;10D經濟型純水儀（上海摩勒科學儀器有限公司）;DNP-9002BS-III電熱恒溫培養箱（上海新苗醫療器械制造有限公司）;96孔DES檢測試劑盒（美國柏爾生物技術公司）;乙酸乙酯、無水CaCl2、甲醇（AR，上海國藥集團化學試劑有限公司）;正己烷（AR，天津科密歐試劑有限公司）。

1.2樣品

中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等苗種樣品分別由國家北方蝦蟹產業技術體系日照站、山東省現代農業刺參產業技術體系日照綜合試驗站和山東省現代農業魚類產業技術體系日照東港綜合試驗站提供。

1.3方法

1.3.1試劑配制

1.3.1.1HRP-Conjugated Antibody 2#溶液配制取100 μl 100×HRP酶標二抗（HRP-Conjugated Antibody 2）加入到9.9 mL二抗稀釋液（Antibody Diluent2 ）中，按1∶99比例將100×HRP-Conjugated Antibody 2稀釋為10 mL的1×HRP-Conjugated Antibody 2。

1.3.1.2Wash Solution洗液配制取10 mL的20×濃縮洗液（Wash Solution）加入到190? mL純水中，按1∶19比例配制1×Wash Solution。

1.3.1.3PBS溶液配制取1 mL的10×緩沖液（PBS）加入到9 mL雙蒸餾水中，按1∶19比例配制成10 mL的1×PBS。

1.3.1.4PBS-甲醇溶液配制取3 mL的1×PBS加入2 mL甲醇，按3∶2比例配制1×PBS-甲醇溶液。

1.3.2樣品處理挑出樣品中餌料等雜質，用去離子水清洗、瀝干，攪碎成糜狀，充分混合均勻;準確稱取樣品（3.00±0.01）g置于25 mL聚丙烯離心管中，加入9 mL乙酸乙酯和0.3 g CaCl2，超聲振蕩20 min，（22.5±2.5）℃ 4 000 r/min離心5 min;移取6 mL上清液，置于10 mL聚丙烯離心管中，（50～60）℃水浴氮氣吹干;加入2.00 mL飽和正己烷溶解殘留物，再加入1.00 mL的1×PBS/甲醇，超聲振蕩15 min;（22.5±2.5）℃ 4 000 r/min離心10 min，棄去上層飽和正己烷層，下層溶液供酶標板進行檢測。

1.3.3孵育過程移取標準溶液或樣品上機液50 μL，置于對應的孔中;再依次加入100 μL DES一抗（Diethylstilbestrol Antibody 1#），輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育30 min;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，每孔及時加入洗滌液250 μL，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，將孔內液體甩干，重復洗板步驟3次，每次間隔10 s，最后一次洗板后，應使板盡量甩干并在吸水紙上倒扣、排干（排干后若有氣泡，先用洗耳球吹破，再拍干）;再按以上順序將每酶標板孔加入150 μL的1×HRP-Conjugated Antibody 2#，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育30 min;按照上述洗板方法再次洗板;每酶標板孔加入100 μL的底物（TMB Substrate），輕輕振蕩混勻1 min，用蓋板膜蓋板后，（22.5±2.5）℃避光孵育15～20 min;每酶標板孔加入100 μL的終止液（Stop Buffer）終止顯色反應，輕敲微孔板邊緣混勻1 min，穩定1 min后，上機測定（上機前30～40 min打開酶標儀，使儀器狀態穩定，并將測試波長設定為450 nm）。

2結果與分析

2.1提取溶劑的選擇

DES為一類脂溶性化合物，易在動物的脂肪及組織中殘留[3]。在前處理過程中，根據樣品的不同性質，一般用叔丁基甲基醚、乙腈、乙酸乙酯、甲醇、乙醇等有機溶劑對待測組分進行提取。近年來，已有研究表明叔丁基甲基醚能引起頭痛、頭暈、惡心等癥狀，具有致突變性及致癌作用[18]，美國 EPA 已將其列入致癌物質名單中[19];乙腈、甲醇、乙醇與水的互溶性較強，會將水產品中部分水溶性蛋白提取出來，帶來更多雜質，使提取液渾濁，不利于后續凈化[20];乙酸乙酯極性與DES極性相近，用乙酸乙酯提取的樣品回收率趨于穩定狀態，為凈化工序提供有力保障，回收率高，效果理想，是DES最佳提取溶液[21-22]。因此，本方法選用乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2振蕩提取的選擇

徐英江等[16]研究發現，對動物源性樣品中DES提取，采用超聲振蕩提取可以使溶劑快速地進入到固體物質中或與液體物質盡快混合，具有縮短提取時間，有效提高萃取率，節約成本等優點;陳溪等[23]對化妝品中DES等7種雌激素采用超聲振蕩提取，經凝膠滲透凈化色譜（GPC）凈化，回收率為69.4%～108.7%;劉美華等[24]用離子液體和分散劑對廢水樣品中DES等組分進行超聲輔助萃取，提高了回收率。綜上所述，采用超聲振蕩的方式對目標組分進行提取已成為一種常態。故本方法將渦旋振蕩提取優化為超聲振蕩提取。但是，超聲提取時間過短容易混合不勻，提取不充分，造成假陰性;超聲提取時間過長會溶解出更多的雜質成分造成乳化現象，把握好超聲振蕩時間是操作的關鍵。

選取中國對蝦苗種、三疣梭子蟹苗種、刺參苗種、牙鲆苗種4種不同基質的DES陰性樣品，每種基質樣品稱取12份，均添加為1.00 μg·kg加標水平，每2份為一組，設6個平行組。固定超聲頻率為40 kHz，分別超聲振蕩5、10、15、20、25、30 min，以考察超聲振蕩時間對DES檢出水平和提取液乳化現象的影響（表1）。試驗結果顯示，超聲時間在5～25 min范圍內，樣品提取液狀態良好，未出現混濁和乳化現象，超聲超過25 min時，樣品提取液開始出現混濁和乳化現象;樣品平均檢出水平在5～20 min范圍內隨著時間的延長而提高，在20 min時達到最大值，在20～25 min范圍內基本不變，超聲時間為30 min時，平均檢出水平明顯降低，這可能是多次用正己烷去乳化層導致DES損失所致。由此可見，超聲振蕩適用于DES的提取，且最佳超聲提取時間為20 min。

2.3加標回收率與精密度（RSD）

GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[25]規定，對食品中禁用藥物，回收率應在方法檢測下限、兩倍方法檢測下限和十倍方法檢測下限進行加標回收率試驗。同大型儀器分析法的自動進樣方式不同，ELISA法是手動進樣，如何正確操作微量移液器是減少偶然誤差、增加微量進樣穩定性、確保精密度、提高加標回收率的關鍵，梁娟等[26]認為“吸二打一”的操作手法是有效解決這一問題的關鍵。本文選取4種不同基質的DES陰性樣品，分別作0.075、0.150和0.750 μg·kg三個加標水平進行檢測，每個加標水平設6組重復，計算平均回收率和RSD。三個加標水平回收率均在74.3%～96.7%之間，RSD測定范圍為3.7%～7.6%（表2）。由此可見，本文所建立的方法具有良好的準確度和RSD，可以對樣品中DES殘留量進行定性、定量測定。

2.4線性范圍及定量限

針對魚、蝦等水產品中可食部分，美國柏爾生物技術公司試劑盒定量檢測下限為0.075 0 μg·kg，本試驗通過對前處理過程進行優化改進，中國對蝦、三疣梭子蟹、刺參、牙鲆等四種不同基質苗種在0.075 0 μg·kg加標水平下，加標回收率和精密度均達到GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[25]的質量控制規定（表3）。與《農業部1163號公告-9-2009 水產品中己烯雌酚殘留檢測 氣相色譜-質譜法》[27]中規定的GC-MS法相比，ELISA法定量限較低、靈敏度較高（表3），DES在0.150～9.00 ng·mL的水平范圍內，標準曲線線性關系良好R2=0.997。

2.5基質效應的考察

不同種類的樣品之間性質差異很大，會產生不同的基質效應，樣品基質對反應的干擾是影響ELISA法檢測結果準確性的一個重要因素。樣品或樣品提取液中的化學物質，如雜蛋白、脂肪、色素等，可能會影響抗體與DES的結合，降低方法靈敏度和穩定性，甚至導致假陽性[28]。根據農業部1192號公告-1-2009《水產苗種違禁藥物抽檢技術規范》[29]中規定，苗種樣品的制備不應只取可食部分，而是整條/只攪碎混合均勻。可能是蟹殼、魚骨、蝦殼等雜質的影響，造成樣品空白的檢出水平偏高，導致中國對蝦、三疣梭子蟹、牙鲆等苗種的基質效應比較明顯，加標回收率相對刺參苗種較低，但四種不同基質樣品的三個加標水平回收率均在74.3%～96.7%之間，精密度測定范圍為3.7%～7.6%（表3），符合水產品質量安全主管部門的規定。由此可見，本方法適用于不同基質水產苗種中DES的測定。

2.6正己烷的優化結果

DES具有很強的親脂性，水產苗種樣品基質復雜、脂肪含量高，提取液極易產生渾濁或乳化現象，不利于DES的提取和凈化，容易在測定過程中產生ME，因此有必要在前處理過程中用正己烷對樣品提取液進行凈化，以將溶液中的雜質、脂肪去除。當乳化現象比較嚴重，乳化層不能一次去除時，需要增加正己烷去脂的次數。但是，用正己烷去脂凈化的同時會導致樣品提取液損失一部分DES，使得目標組分檢出水平降低，容易導致樣品的假陰性。將正己烷用純水進行飽和，可以減少DES的損失，提高檢測結果的準確性。

本文用DES陰性樣品作1.00 μg·kg加標水平，分別用正己烷試劑和飽和正己烷進行去脂，每種去脂方式設3組重復，分別計算平均檢出水平。結果顯示，用飽和正己烷去脂的樣品檢出濃度較高（表4），由此可見用純水對正己烷試劑進行飽和的必要性。

2.7溫度對測定值的影響

ELISA法測定溫度應嚴格控制在（22.5±2.5）℃，溫度過高或過低，都不利于抗原抗體有效結合，降低靈敏度和方法穩定性。當0濃度標準點的吸光度值（B0）低于0.6時，表示試劑可能變質[28，30]。但是，不同批次的試劑盒可能顯示不同的B0值，相對吸光度值具有很好的穩定性。梁康建等[28]通過試劑盒穩定性實驗得知，50%抑制DES濃度的吸光度值（B）與0濃度標準點的吸光度比值高于0.7（即B/B0>0.7）時，即可判定ELISA試劑盒已失效。試劑盒應在2～8 ℃溫度下儲存，在37 ℃溫度下放置1 d，相當于在4 ℃溫度下放置45 d，使試劑盒保質期縮短。

3結論與討論

ELISA法的缺點是影響因素較多，易出現大量假陽性結果，抗體批次不同，測定結果也會出現差異。但大型儀器分析方法對儀器設備要求較高，樣品前處理過程復雜，難以實現大量樣品現場快速檢測。與大型儀器分析方法相比，ELISA法具備靈敏快捷、精密度高、分析成本低、操作步驟簡單、有機試劑使用量少、對人體傷害和環境污染危險性小等優勢。通過多年實際檢測結果得知，用本方法檢出的陽性樣品，后續又用GC-MS法對其結果進行確證，檢測結果一致。由此可見，本方法可用于實際樣品檢測，能夠較好地滿足水產苗種質量安全監管部門的需要，是目前水產苗種質量安全檢測工作中值得推廣的方法。參考文獻：

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for diethylstilbestrol in aquatic seedlings with different substrates

LIANG Juan WEI Haiying，YU Mengmeng，Zhang Qianyu，MU Dandan，ZHAO Taotao

（Rizhao Marine and Fishery Research Institute，Rizhao 276826，China）

Abstract：In order to establish an enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） method for the qualitative and quantitative detection of diethylstilbestrol （DES） residues in aquatic seedlings，the pretreatment process was optimized by using ethyl acetate as extractant，ultrasonic oscillation extraction instead of vortex oscillation extraction，and n-hexane saturation with pure water.At the same time，the influence of matrix effect on the detection results was investigated.Diethylstilbestrol had good linear in the range of 0.150～9.00 ng·mL-1，with the correlation coefficients R2=0.997，and the detection limit was 0.075 μg·kg-1; The average recoveries ranged from 74.3%～96.7% at the spiked level of 0075，0.150 and 0.750 μg·kg-1 in the seedlings of Penaeus chinensis，Portunus trituberculatus，Stichopus japonicus and Paralichthys olivaceus.The relative standard deviations was 3.7%～7.6%.The results showed that this method was accurate，rapid and cheap，which would be suitable for qualitative and quantitative analysis of diethylstilbestrol residues in aquatic seedlings with different substrates.

Key words：aquatic seedlings; diethylstilbestrol; residue; different substrates; ELISA