解淀粉芽孢桿菌BA118 高密度發酵工藝研究

喬香君，吳 影，趙麗娜，古紹彬

（1. 鄭州航空港經濟綜合實驗區綜保區和口岸服務局，河南鄭州 450019；2. 河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽 471003；）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens） 屬于一種對人畜無毒害的G+細菌，產芽孢[1-2]。其芽孢可在胃腸道中生存和發芽[3]，并代謝分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶[4]，增強腸內營養物質的消化率和吸收能力[5]。同時，還具有較強的抗逆能力和廣譜抗菌活性[2，6]，穩定性好，能調節動物免疫力，可作為抗生素生長促進劑的替代品[7-10]，在動物生產中越來越受到重視。Gu W 等人[11]研究發現，將解淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238 喂食尼羅羅非魚（Oeochromis niloticus）可以提高生長性能，并提高對產氣莢膜梭菌的抗病能力。Lei X 等人[12]證明解淀粉芽孢桿菌可提高肉雞生產性能，減輕免疫應激，并且改善腸道菌群介導的病原體抗性。Wang Y 等人[13]發現B. amyloliquefaciensSC06 可調節宿主代謝和腸道菌群，保護小鼠免受高脂飲食誘導的肥胖和肝損傷。此外，研究發現淀粉芽孢桿菌BLCC1-0238 可通過提高產蛋雞的免疫力，和調節其生殖激素來有效提高產蛋性能和蛋品質[14]。

另外，解淀粉芽孢桿菌可以產生多種胞外酶，能夠促進大分子營養物質的消化吸收，提高腸道吸收力和營養消化率[15-16]。加拿大衛生部批準解淀粉芽孢桿菌作為淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶和半纖維素酶等食品酶的來源，被越來越多地應用到食品加工中[15，17]。因此，近些年解淀粉芽孢桿菌也成為應用廣泛的益生菌之一[18-20]。目前，國內外學者多采用固體發酵法獲得生產中使用的解淀粉芽孢桿菌[21]，但這種方法制備的是菌體與發酵基質的混合物，很難分離得到解淀粉芽孢桿菌，不利于用解淀粉芽孢桿菌的工業化生產食品酶。

為了進一步提高解淀粉芽孢桿菌BA118 菌株液體發酵水平，在單因素試驗的基礎上，通過響應面設計試驗，對BA118 的工業發酵培養基和發酵條件進行了優化，確定了該解淀粉芽孢桿菌BA118 高密度培養的發酵工藝，為其在工業化生產中的應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌BA118，保藏于河南科技大學微生物實驗室。

1.2 儀器和試劑

WFZ·UV-2800AH 型紫外- 可見分光光度計，尤尼柯產品；PHS-25 型pH 計，雷磁產品。

玉米淀粉、土豆淀粉、玉米漿、黃豆餅粉，市售；糊精，北京奧博星生物技術有限責任公司提供。

1.3 培養基

（1） 牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0~7.2，固體需加2%的瓊脂。

（2） 基礎發酵培養基（g/L）。可溶性淀粉10.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0。

1.4 試驗方法

1.4.1 種子液的制備

將解淀粉芽孢桿菌的保藏菌種接種到牛肉膏蛋白胨固體斜面培養基，于37 ℃下培養24 h，備用。取2 環活化菌種，接入裝有50 mL 牛肉膏蛋白胨培養基的250 mL 三角瓶中，37 ℃下以轉速180 r/min振蕩培養24 h，制成種子液。

1.4.2 解淀粉芽孢桿菌BA118 培養方法

將種子液接種于牛肉膏蛋白胨液體培養基，接種量5%，裝液量30/250 mL，于37 ℃下以轉速180 r/min 振蕩培養24 h。

1.4.3 菌體計數方法

（1） 平板計數。參照文獻[22]。

（2） 比濁法。參照文獻[23]。

1.4.4 發酵條件優化

通過單因素試驗分別考查發酵時間、初始pH值、發酵溫度、接種量、轉速和裝液量對解淀粉芽孢桿菌BA118 發酵菌體密度的影響。

1.4.5 培養基優化單因素試驗

（1） 碳源。選擇蔗糖、麥芽糖、糊精、玉米淀粉、土豆淀粉為替代碳源。

（2） 氮源。分別以牛肉膏、玉米漿、黃豆餅粉、胰蛋白胨+尿素（質量分數比1∶1）、胰蛋白胨+酵母膏+尿素（2∶2∶1） 替代基礎發酵培養基中的大豆蛋白胨制成培養基。

（3） 無機鹽。分別以MgSO4、CaCO3、MnSO4、KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 為替代無機鹽。

1.4.6 響應面試驗優化發酵培養基

在單因素試驗結果的基礎上，選取糊精、玉米漿、MgSO4和KH2PO4+K2HPO4為自變量，運用Design Expert 8.0.5 設計四因素三水平響應面試驗。以菌體密度為響應值，采用數據處理軟件進行響應曲面分析，對解淀粉芽孢桿菌發酵培養基進行優化。對響應曲面分析得到的最佳培養條件進行3 次平行發酵試驗，取平均值，驗證模型結果是否可靠，得出最終優化結果。

1.4.7 數據統計與分析

試驗數據采用Excel 作圖，用SPSS 22.1 軟件進行差異顯著性分析。所有數值在p＜0.05 時均被認為是顯著的，并以平均值±s.e 表示。

2 結果與分析

2.1 BA118 生長特性研究

每2 h 取發酵樣品測定OD600nm 光密度值，以發酵時間為橫坐標，以光密度值為縱坐標，繪制解淀粉芽孢桿菌BA118 的標準生長曲線。

BA118 發酵條件的優化見圖1。

由圖1（a） 可知，BA118 在0~4 h 處于生長延滯期；4~26 h 為該菌的對數生長期；26~32 h 時達到平臺期；在32 h 后，菌體進入衰亡期，活菌數呈下降趨勢。因此，選擇BA118 的最佳發酵時間為28 h。

圖1 BA118 發酵條件的優化

2.2 發酵條件的優化

2.2.1 pH 值對BA118 生長的影響

微生物都有其最適生長pH 值，B. amyloliquefaciens的最適生長pH 值在7.5 上下，菌株之間的最適pH 值存在一定差異[24]。將種子液分別接種于pH 值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的液體培養基中，培養28 h后平板計數得出不同pH 值對菌體發酵水平影響的折線圖。

由圖1（b） 可知，初始pH 值為6.0~8.0 時，發酵菌體數量達到2.34×108~2.48×108CFU/mL，在pH 值7.5 時，BA118 菌體數量達到最大值，可見初始pH 值對菌體數量影響不大。車曉曦等人[25]研究了解淀粉芽孢桿菌SAB-1 發酵條件的優化，發現初始pH 值在5.0~8.0 的條件下，發酵產量差別不大，與試驗結果一致。但SAB-1 在pH 值6.0 時菌體數量達到最高峰，在pH 值7.0 時產量最低，與試驗中BA118 的最適pH 值7.5 不同，反映出不同的解淀粉芽孢桿菌菌株的最適生長pH 值有差異的特點。

2.2.2 培養溫度對BA118 生長的影響

將種子液接種于最適pH 值的牛肉膏蛋白胨培養基中，在培養溫度分別為25，30，35，40，45 ℃下培養48 h，然后平板計數。由圖1（c） 可知，發酵溫度為20~30 ℃時，菌體的生長代謝隨著溫度的升高而加快；30 ℃為BA118 最適生長溫度，菌體數量達到2.7×108CFU/mL。

2.2.3 溶氧量對BA118 生長的影響

發酵液的溶氧濃度直接影響微生物的酶的活性、代謝途徑及產物產量[26-27]。發酵液的溶氧量的主要受裝液量和轉速影響。在其他發酵條件相同的前提下，分別以150，170，190，210，230 r/min 的轉速對解淀粉芽孢桿BA118 進行發酵，獲得不同轉速對BA118發酵水平影響的折線。由圖1（d） 可知，隨著轉速的不斷增加，菌體數量呈上升趨勢，并在230 r/min時取得最大值。解淀粉芽孢桿菌BA118 為好氧菌，故轉速越高，通氣量越大，菌株生長越旺盛。將種子液分別接種到裝液量為20/250，30/250，40/250，50/250 mL 的最適pH 值的牛肉膏蛋白胨培養基中，最適條件下培養，平板計數。由圖1（e） 可知，菌體數量隨裝液量的增加呈現先增加后減少趨勢，并在40/250 mL 時取得最大值。當裝液量少于40/250 mL時，發酵液中的碳氮源等營養成分較少，菌體生長受到限制；當裝液量大于40/250 mL 時，溶氧含量降低，影響微生物的有氧呼吸，導致活菌數量下降。因此，選擇BA118 的裝液量為40/250 mL，發酵轉速為230 r/min。

2.2.4 接種量對BA118 生長的影響

接種量對菌體生長影響較大，合適的接種量能提高微生物對培養基的利用率，加速菌株的生長[28]；分別以1%，2%，3%，4%，5%的接種量進行發酵，平板計數。由圖1（f） 可知，BA118 的最適接種量為2%，過大的接種量會大大消耗發酵液中的營養成分，并代謝產生過多的次級代謝產物而影響菌體的生長[29]。

通過單因素試驗確定，在pH 值7.5，溫度30 ℃，轉速230 r/min，接種量2%，裝液量40/250 mL 條件下進行發酵時，菌體數量達到最高，為3.73×108CFU/mL。

2.3 BA118 液體發酵培養基的優化

2.3.1 碳源、氮源和無機鹽對菌體數量的影響

BA118 發酵培養基優化見圖2。

由圖2 可知，當碳源為5 g/L 糊精時，菌體數量明顯高于其他碳源。氮源為牛肉膏和玉米漿時，對BA118 的發酵水平影響較大。玉米漿營養豐富，含有多種氨基酸、可溶性蛋白、生物素、維生素、金屬離子和糖等，能夠替代酵母粉、牛肉膏，降低生產成本[30]。因此，確定10 g/L 玉米漿為BA118 生長所需最佳氮源。在無機鹽試驗中發現，添加3 g/L MgSO4和7 g/L KH2PO4+K2HPO4兩類無機鹽時，均獲得了較高生物量，確定MgSO4和KH2PO4+K2HPO4同時為BA118 生長所需無機鹽。通過單因素試驗篩選出BA118 的最適培養基為糊精5 g/L，玉米漿10 g/L，MgSO43 g/L和KH2PO4+K2HPO47 g/L。

圖2 BA118 發酵培養基優化

但上述單因素試驗無法分析各營養因素之間的交互作用，響應面法通過回歸方程擬合建立各因素與響應值之間的函數關系，分析優化各因素的工藝參數，并可預測響應值[31]，是一種能高效降低試驗次數且準確的分析模型。

2.3.2 Box- behnken 響應面試驗

（1） 響應面分析試驗設計與結果。由單因素試驗選取糊精、玉米漿、MgSO4和KH2PO4+K2HPO44 個因素為自變量，設計四因素三水平的響應面分析。

響應面分析因素與水平設計見表1，Box-behnken試驗設計及結果見表2。

表1 響應面分析因素與水平設計/g·L-1

表2 Box-behnken 試驗設計及結果

應用Design Expert 8.0.5 軟件對上述表2 中各試驗點的響應值進行回歸分析，用于研究顯著因素糊精添加量（A），玉米漿添加量（B），MgSO4添加量（C） 和KH2PO4+ K2HPO4添加量（D） 之間的相互作用，并確定其最佳水平。得到菌體數量（Y） 對自變量的二次多項回歸模型方程：

回歸方程的方差分析見表3。

由表3 可知，該二次模型多元相關性系數R2=0.929 5，表明僅有7.05%的變異不能由此模型解釋；因變量菌體數量與本研究所考查自變量之間的回歸模型極顯著（p＜0.01），表明數據與模型擬合良好、模型成立，擬合程度較高；失擬項p值為0.098 3，表明失擬項不顯著，說明試驗所得的二次方程能較好的對響應值進行預測，即能較好地預測菌體數量隨MgSO4、玉米漿、糊精、KH2PO4+K2HPO4的變化規律。從回歸方程可知，B，A2，B2，C2，D2極顯著（p＜0.01），A，C，AD，BC，BD顯著（p＜0.05），其他影響均不顯著（p＞0.05）。各自變量對菌體數量影響的主次因素依次為玉米漿＞硫酸鎂＞糊精＞KH2PO4+K2HPO4。

表3 回歸方程的方差分析

（2） 響應面交互作用分析。根據上述擬合回歸方程，通過軟件分析得到交互因子的響應面圖和等高線圖。發現3 個響應表面圖都具有一個帶有向下開口的凸表面。每個響應曲面代表著，2 個因素保持在編碼水平的0 水平，另外2 個獨立因素之間的交互作用。通過響應面圖曲面的坡度變化和等高線圖的形狀，可以判斷出優化因子之間交互作用的強弱。若響應面圖曲面坡度比較陡峭，說明該因素對響應值比較敏感；相反，若響應面圖曲面比較平緩，說明該因素對響應值不敏感。從等高線圖的形狀分析，如果為圓形，說明因素間交互作用弱；如果為橢圓形，代表因素間交互作用較強[32-33]。

AD交互作用對BA118 菌體數量的影響見圖3，BC交互作用對BA118 菌體數量的影響見圖4，BD交互作用對BA118 菌體數量的影響見圖5。

圖4 BC 交互作用對BA118 菌體密度的影響

由圖3 ~圖5 可知，發酵液BA118 菌體數量隨著糊精、玉米漿、硫酸鎂和KH2PO4+K2HPO4添加量的變化，均呈現先增大后減小的趨勢，曲面的頂點即為菌體數量最大值點。其中，糊精和KH2PO4+K2HPO4的交互作用，玉米漿和硫酸鎂的交互作用，以及玉米漿和KH2PO4+K2HPO4的交互作用的響應面曲面的坡度陡峭，等高線圖呈橢圓形，表明兩因子交互作用較強。

圖3 AD 交互作用對BA118 菌體數量的影響

圖5 BD 交互作用對BA118 菌體數量的影響

（3） 響應面優化結果驗證。結合響應值與各因素關系的二階經驗模型及三維響應面圖，確定發酵液的最優配方各組分質量濃度為玉米漿11.36 g/L，糊精5.50 g/L，MgSO43.38 g/L，KH2PO4+K2HPO45.96 g/L。在優化配方條件下，獲得的解淀粉芽孢桿菌BA118菌體數量的理論預測值為6.345 51×109CFU/mL。結合試驗實際操作，將培養基各組分質量濃度調整為糊精5.50 g/L，玉米漿11.50 g/L，MgSO43.50 g/L，KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 6.00 g/L。為驗證預測結果，在該配方下進行搖瓶發酵試驗（重復3 次），結果發酵獲得的菌體數量分別為6.33×109，6.61×109，6.98×109CFU/mL，均值為6.64×109CFU/mL，與響應面理論預測值6.345 51×109CFU/mL 基本吻合，證實了響應面模型的有效性。

3 結論

通過單因素試驗與響應面設計分析，確定了解淀粉芽孢桿菌BA118 的最佳發酵條件為培養時間28 h，初始pH 值7.5，培養溫度30 ℃，轉速230 r/min，接種量2%，裝液量40/250 mL。發酵培養基最佳配方各組分質量濃度為糊精5.50 g/L，玉米漿11.50 g/L，硫酸鎂3.50 g/L，磷酸氫二鉀+磷酸二氫鉀6.00 g/L。通過發酵條件和發酵培養基的工藝優化，最終將菌體產量提高了28.3 倍，菌體數量達到6.64×109CFU/mL，為解淀粉芽孢桿菌的工業化生產奠定了基礎。