FOXP3 基因沉默抑制肺腺癌A549 細胞上皮-間質轉化和改善5-氟尿嘧啶耐藥性①

歷 春 王鶴霏 何程遠 房 惠 裴怡杰 蓋曉東

（北華大學基礎醫學院免疫學教研室，吉林 132013）

肺癌是全球發病率和病死率最高的惡性腫瘤，其五年生存率不超過17%［1-2］。目前，肺腺癌的發病率逐年上升，已超過肺鱗癌成為肺癌中最常見的組織學類型［3］。多數患者就診時已屬中晚期，盡管采用手術、放療和化療等綜合治療措施，腫瘤復發、轉移和對化療藥物不敏感是影響臨床治療和預后的主要因素［4］。

上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）是上皮細胞失去極性轉變成具有遷移能力的間質細胞，主要表現為上皮細胞標志分子E-鈣黏蛋白（E-cadherin）表達下調，間質細胞標志分子波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）表達上調，也是肺腺癌發生轉移的關鍵步驟［5-6］。此外，EMT 在腫瘤耐藥中也發揮重要作用，腫瘤細胞可通過獲得間質細胞表型產生對化療藥物的耐藥［7］。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是目前臨床上廣泛應用的化療藥物，其可通過干擾核酸的合成而抑制腫瘤細胞的增生，還可抑制腫瘤細胞EMT，多與其他化療藥物聯合應用治療肺腺癌［8-9］。研究發現，超過50%以上的肺腺癌細胞具有間質表型，且與轉移和復發呈正相關［10-11］。因此，逆轉EMT 是有效治療肺腺癌、改善預后的關鍵環節。

叉頭蛋白3（forkhead box protein 3，FOXP3）是調節性T 細胞（regulatory T cells，Tregs）的特異性標志物，可通過發揮免疫抑制功能參與腫瘤免疫逃逸［12］。近年研究發現，FOXP3 在多種腫瘤細胞高表達，可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲轉移，其表達水平與患者預后呈負相關［13-15］。課題組前期工作發現，FOXP3 在肺腺癌細胞高表達，具有促進細胞增殖、淋巴結轉移等惡性生物學行為，并可降低順鉑和阿霉素的敏感性，但其在EMT 和5-FU 耐藥性中的作用尚未闡明［16-18］。因此，本研究通過RNAi 技術抑制FOXP3 在肺腺癌A549 細胞株中的表達，旨在明確FOXP3 與EMT 和5-FU 耐藥的關系，擬為肺腺癌的免疫治療提供潛在的分子靶點，有望改善肺腺癌患者的預后。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌A549細胞株購自中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養基購自美國Hyclone 公司；新生牛血清購自天杭生物科技股份有限公司；FOXP3 siRNA 序列及陰性對照序列由廣州銳博生物技術有限公司合成；LipofectaminTM2000 試劑盒購自 賽 默 飛 世 爾；TRIzol，PrimeScriptTMRT 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司；PCR 引物由生工生物工程有限公司合成；基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9 ELISA 試劑盒、FOXP3 抗體購自武漢博士得生物工程有限公司；Transwell 小室購自美國Corning公司；Matrigel 膠購自美國BD公司；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、ECL 發光試劑盒、CCK-8 試劑盒以及E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和GAPDH 抗體購自碧云天生物技術有限公司；5-FU 購自上海旭東海普藥業有限公司；P-糖蛋白（P-gp）抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人肺腺癌A549細胞株培養于含10%新生牛血清的高糖DMEM 培養基中，置于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的孵箱中常規培養。

1.2.2 細胞轉染與5-FU 處理細胞 選取第3 代細胞以2.5×105個/孔的密度接種于6孔板，待細胞貼壁后進行siRNA轉染。轉染實驗分為3組：陰性對照組（si-NC）、si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組。si-FOXP3-1引物序列：5'-CAUGGACUACUUCAAGUUCdTdT-3'；si-FOXP3-2 引 物 序 列：5'-GAGAGAUGGUACAGU?CUCUdTdT-3'。轉染步驟參照LipofectamineTM2000說明進行，分別于轉染后6 h 更換為含血清的DMEM培養基。

選取第3 代細胞以5×105個/孔的密度接種于6 孔板，待細胞貼壁后加入12.5 μg/ml 的5-FU 作為5-FU 處理組，0 μg/ml 的5-FU 作為未處理組，48 h 收集細胞進行檢測。

1.2.3 qRT-PCR 實驗 收集轉染48 h及5-FU 處理48 h 的各組細胞，TRIzol 裂解法提取總RNA，用PrimeScripTMRT 試劑盒逆轉錄合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時PCR，條件如下：95 ℃15 min，95 ℃10 s，60 ℃10 s 退火，40 個循環。FOXP3引物序列F：5′-CACAACATGCGACCCCTTTCACC-3′，R：5′-AGGTTGTGGCGGATGGCGTTCTTC-3′；GAPDH 引物序列F：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，R：5′-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3′。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA含量。

1.2.4 Western blot 實驗 收集轉染72 h 及5-FU處理48 h 的各組細胞，提取細胞總蛋白并測定蛋白濃度，每孔加入30 μg 蛋白，行10%SDS-PAGE 電泳，濕轉方式移至PVDF 膜，5%BSA 室溫下封閉1 h。分別滴加一抗FOXP3（1∶300）、E-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、P-gp（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）于4 ℃過夜。TBST 沖洗后室溫孵育HRP標記的IgG抗體（1∶2 000）1 h，加入ECL顯色底物發光并拍照。以GAPDH作為內參，以目標條帶與內參照條帶的灰度值比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.2.5 Transwell小室遷移和侵襲實驗 取轉染48 h的各組細胞，用無血清培養基調整密度為5×105個/ml。遷移實驗：取100 μl 加入Transwell 上室，下室中加入500 μl 含10%血清的DMEM 培養基。20 h 后，用4%多聚甲醛固定30 min，蘇木素染色5 min，水洗后用棉簽輕輕拭去Transwell 小室上層未遷移的細胞，200 倍顯微鏡下隨機5 個視野觀察細胞并計數。侵襲實驗：用預冷的無血清DMEM 培養基以1∶8 稀釋Matrigel，各組上室加入80 μl，置37 ℃孵箱2 h。其余步驟同遷移實驗。

1.2.6 ELISA 實驗 取轉染72 h 的各組細胞培養上清各1 ml，2 000 r/min 離心10 min，按照MMP-2 和MMP-9 ELISA 說明書步驟嚴格操作。全自動酶標分析儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）值，依標準品值制作標準曲線，計算MMP-2和MMP-9蛋白含量。

1.2.7 CCK-8 實驗 取轉染24 h 的各組細胞，5×103個/孔、100 μl 培養基接種于96孔板，貼壁后分別加入不同濃度的5-FU（0、3.125、6.25、12.5、25和50 μg/ml），每個濃度設置6個復孔，并設置空白對照。48 h后10 μl/孔加入CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。酶標分析儀在450 nm 波長處測量各孔OD 值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率（%）=（對照組平均OD 值-給藥組平均OD 值）/對照組OD 值×100%，并進一步用SPSS 統計軟件計算細胞生長抑制50%的藥物濃度（IC50）。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0 統計軟件分析，實驗數據以±s表示，兩組間差異比較采用配對t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。所有實驗重復3次。

2 結果

2.1 轉染si-FOXP3后各組細胞FOXP3表達情況為驗證FOXP3 siRNAs 轉染A549 細胞的效果，采用qRT-PCR 和Western blot 方 法，分 別 在 轉 染48 h 和72 h 檢測各組細胞中FOXP3 的表達。結果顯示，與si-NC 組 相 比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組FOXP3 mRNA 和蛋白表達均顯著降低（P<0.01），見圖1。結果提示成功沉默A549細胞中FOXP3的表達。

圖1 轉染si-FOXP3后A549細胞FOXP3表達Fig.1 Expressions of FOXP3 in A549 cells transfected with si-FOXP3

2.2 FOXP3 沉默對EMT 的影響 為明確FOXP3與EMT 之間的聯系，采用Western blot 實驗檢測FOXP3沉默后各組細胞EMT 相關標志物表達，包括間質標志物Vimentin、N-cadherin 和上皮標志物E-cadherin。結果顯示，與si-NC 組相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2組Vimentin 和N-cadherin 蛋白表達均顯著降低（P<0.01），E-cadherin 蛋白表達均顯著升高（P<0.01），見圖2。結果表明，FOXP3沉默可抑制A549細胞EMT。

圖2 FOXP3 沉 默 對Vimentin、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表達的影響Fig.2 Effects of FOXP3 silencing on protein expressions of Vimentin，N-cadherin and E-cadherin

2.3 FOXP3 沉默對細胞遷移和侵襲的影響 為明確FOXP3 在EMT 中的具體作用，Transwell 遷移和侵襲實驗檢測FOXP3 沉默后各組細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組跨膜和穿過基質膠的細胞數與si-NC 組相比均顯著減少（P<0.01），見圖3。結果表明，FOXP3沉默可顯著降低A549細胞的遷移和侵襲能力。

圖3 FOXP3沉默對A549細胞遷移和侵襲能力的影響（×400）Fig.3 Effects of FOXP3 silencing on migration and invasion abilities of A549 cells（×400）

2.4 FOXP3 沉默對MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影響 為探討FOXP3 促進A549 細胞遷移和侵襲的相關分子機制，ELISA 實驗檢測FOXP3 沉默后各組細胞上清中MMP-2和MMP-9的表達。結果顯示：與si-NC 組相比，si-FOXP3-1和si-FOXP3-2組細胞上清中MMP-2和MMP-9蛋白含量均顯著降低（P<0.01），見圖4。結果表明，FOXP3 沉默可通過抑制MMP-2和MMP-9 表達進而降低A549 細胞的遷移和侵襲能力。

圖4 FOXP3沉默對MMP-2和MMP-9蛋白含量的影響Fig.4 Effects of FOXP3 silencing on protein concentra?tions of MMP-2 and MMP-9

2.5 5-FU 作用于A549 細胞對FOXP3 表達的影響 為探討FOXP3 與5-FU 耐藥性之間的聯系，收集5-FU（12.5 μg/ml）處理48 h 的A549 細胞，qRTPCR 和Western blot 實驗分別檢測FOXP3 的表達。結果顯示：5-FU處理組FOXP3 mRNA 和蛋白均顯著高于未處理組（P<0.05），見圖5。結果表明，5-FU作用A549 細胞可上調FOXP3 表達，提示FOXP3 可能參與5-FU誘導的耐藥作用。

圖5 5-FU作用的A549細胞FOXP3表達Fig.5 FOXP3 expression in 5-FU treated A549 cells

2.6 FOXP3 沉默對5-FU 敏感性的影響 為明確FOXP3 在5-FU 耐藥中的作用，選用不同濃度的5-FU 作用于各組細胞，CCK-8 法檢測各組細胞活性，計算細胞增殖抑制率和IC50值。與si-NC 組比較，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2 組細胞增殖抑制率均顯著增加，在6.25、12.5、25 和50 μg/ml 濃度時差異顯著（P<0.05），IC50值也明顯降低。結果表明，FOXP3 沉默可顯著增加A549 細胞對5-FU 的敏感性，見表1。

表1 FOXP3沉默對A549細胞5-FU耐藥性的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

表1 FOXP3沉默對A549細胞5-FU耐藥性的影響（±s，n=3）Tab.1 Effects of FOXP3 silencing on 5-FU resistance of A549 cells（±s，n=3）

Note：Compared with si-NC group，1）P<0.05.

IC50/（μg·ml-1）13.90 8.52 9.09 Groups si-NC si-FOXP3-1 si-FOXP3-2 Inhibition rate of various concentrations of 5-FU/%3.125/（μg·ml-1）27.7±1.76 32.6±2.08 31.7±1.51 6.250/（μg·ml-1）33.9±2.12 43.4±1.621）41.5±2.051）12.500/（μg·ml-1）45.1±1.45 54.5±1.571）53.7±2.201）25.000/（μg·ml-1）61.7±3.61 72.8±2.561）71.7±2.511）50.000/（μg·ml-1）72.5±2.50 79.1±3.121）78.5±3.551）

2.7 FOXP3 沉默對P-gp 表達的影響 為探討FOXP3 促進5-FU 耐藥的分子機制，Western blot 實驗檢測FOXP3 沉默后各組細胞中P-gp 的表達。結果顯示，與si-NC 組相比，si-FOXP3-1 和si-FOXP3-2組P-gp 表達水平均顯著降低（P<0.01），見圖6。結果提示，FOXP3 沉默可通過抑制A549 細胞P-gp 表達進而影響5-FU的耐藥性。

圖6 FOXP3沉默對P-gp表達的影響Fig.6 Effects of FOXP3 silencing on P-gp expression in A549 cells

3 討論

研究報道，FOXP3 可促進肺腺癌細胞的增殖，可通過上調細胞周期蛋白表達誘導細胞從G1期向S 期轉化從而調控細胞的生長［19］。本課題組前期報道，FOXP3 在肺腺癌細胞的表達與淋巴結轉移及TNM 分期呈正相關，還可通過抑制免疫抑制因子IL-10 和TGF-β 的分泌抑制T 淋巴細胞增殖，表明FOXP3 與肺腺癌侵襲和轉移關系密切，但其作用的相關機制尚未完全闡明［16-17，20］。

EMT 是腫瘤細胞發生侵襲轉移的重要環節，是腫瘤細胞擺脫細胞間黏附和突破細胞外基質（extra?cellar matrix，ECM）獲得遷移和侵襲能力的動態過程［21］。臨床研究發現，具有EMT 表型的肺腺癌細胞，其侵襲性和轉移能力更強［10-11］。因此，本研究通過RNA 干擾（RNAi）技術沉默人肺腺癌細胞FOXP3基因的表達，探究其在EMT 過程中的作用。本課題組發現，FOXP3 表達下調可顯著增強上皮細胞標志E-cadherin 表達，抑制間質細胞標志Vimentin 和N-cadherin 表達，表明FOXP3 基因沉默可逆轉肺腺癌細胞EMT 表型。Transwell 小室遷移和侵襲實驗進一步證實FOXP3 在促進肺腺癌細胞遷移和侵襲過程中的重要作用。LIU等［22］探究FOXP3在宮頸癌侵襲的作用中發現，FOXP3 沉默可顯著抑制宮頸癌細胞的侵襲能力、并上調E-cadherin和下調Vimentin的表達，表明FOXP3可通過EMT促進宮頸癌細胞的侵襲，與本研究中的結果一致。ECM 和基底膜的降解是EMT 過程的關鍵步驟，MMP-2 和MMP-9 是降解ECM 和基底膜最主要的基質金屬蛋白酶，在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用［23］。本研究發現肺腺癌細胞FOXP3 基因沉默后MMP-2 和MMP-9 表達顯著降低，表明FOXP3可能通過調控MMP-2和MMP-9的表達促進ECM 降解，進而增強肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力，參與EMT過程。

臨床上，5-FU 多與阿霉素等化療藥物聯合應用治療肺腺癌［9］。本課題組前期工作發現，FOXP3 可降低阿霉素和順鉑的敏感性［17-18］。另有研究報道5-FU 可通過抑制腫瘤細胞EMT 發揮抗腫瘤作用［8］。結合本研究結果FOXP3可促進肺腺癌細胞EMT，推測FOXP3 可能與5-FU 耐藥有關聯。實驗結果證實了本研究的推測，FOXP3的表達在5-FU處理肺腺癌細胞后顯著上調，表明5-FU 的耐藥作用可能與FOXP3 的表達水平有關。為明確FOXP3 在5-FU 耐藥中的具體作用，本研究通過細胞毒實驗檢測FOXP3基因沉默后5-FU對肺腺癌細胞的殺傷效果。結果發現FOXP3表達下調后，5-FU作用下的細胞抑制率顯著增加，IC50也明顯降低，提示抑制FOXP3 表達可改善肺腺癌細胞對5-FU 的耐藥性。化療耐藥的主導機制之一是細胞膜轉運蛋白表達增加從而導致化療藥物的外排［24-25］。P-gp 具有ATP 依賴的藥物外排泵功能，能將進入細胞內的藥物泵出細胞外，從而降低細胞內的藥物濃度［26］。本研究發現FOXP3 基因沉默可顯著抑制P-gp 表達，提示FOXP3可能通過調控P-gp表達增加5-FU外排導致耐藥。

綜上所述，FOXP3 基因沉默可以抑制肺腺癌細胞EMT，改善肺腺癌細胞對5-FU的耐藥性。本研究結果為阻斷肺腺癌的侵襲、轉移以及改善肺腺癌的耐藥提供新的研究思路。