利多卡因通過PI3K/Akt途徑抑制人口腔癌細胞HN13增殖并促進其凋亡①

常冰梅 肖瑞琳 趙 虹 楊小慶 張 棟 王麗麗

（山西醫科大學生物化學與分子生物學教研室，太原 030001）

口腔癌是指發生于口腔的惡性腫瘤，其病理分型以鱗狀細胞癌最為多見，按發生部位分為舌癌、牙齦癌、頰癌、腭癌、上下頜骨癌、唇癌、口底癌、口咽癌、涎腺癌和上頜竇癌以及發生于顏面部皮膚的癌癥［1-2］?？谇话轭^頸部較為常見的惡性腫瘤之一，其發病率約占全身惡性腫瘤發病率的5%，我國口腔癌發病率為3.6/10 萬～8.0/10 萬，已居全身惡性腫瘤發病率第10 位［3］?？谇话┚哂胁〕踢M展快、腫瘤浸潤廣、預后差等特點，對人類生命健康造成極大威脅。

近年局部麻醉藥抗腫瘤的作用及機制逐漸受到重視。已有研究表明，局部麻醉藥能夠影響部分腫瘤細胞凋亡、增殖、轉移、癌基因表觀修飾等行為［4-5］。臨床上利多卡因和其他局部麻醉劑可用于緩解腫瘤患者來自口腔或直腸的癌癥疼痛，目前認為其在口腔使用局部麻醉劑緩解癌痛的同時可抑制口腔癌細胞擴散，其機制可能為利多卡因通過抑制酪氨酸激酶受體EGFR 活性途徑抑制凋亡［6］。但不同局部麻醉藥對不同惡性腫瘤的抗腫瘤作用效果有所不同。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/Akt 信號通路對細胞增殖、分化、凋亡都起著關鍵的調控作用，大量數據表明該通路在多種腫瘤細胞中呈過度激活狀態，且與腫瘤發生、發展、預后密切相關［7］。基于此，本文就利多卡因在抑制人口腔鱗癌細胞增殖及機制方面進行了進一步研究，以期為利多卡因在口腔腫瘤的應用提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人口腔鱗細胞HN13（Cellbio 公司）；DMEM 細胞培養液（Gibco 公司）；10%胎牛血清（FBS，杭州四季青生物材料有限公司）；順鉑注射液（云南植物藥業有限公司）；利多卡因注射液（四環藥業）；FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（Invitrogen公司）；CCK-8 試劑盒（碧云天生物技術研究所）；兔抗人p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、GAPDH一抗（Cell Signaling公司）；過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 及eECL 高靈敏度化學發光試劑盒（博士德生物公司）；GELDOC XR凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與傳代 采用DMEM 培養基培養癌細胞株HN13，其中含10%胎牛血清、100 U/ml 青霉 素、100 U/ml 鏈 霉 素，pH=7.2～7.4，于5%CO2、37 ℃、90%相對濕度下培養。每2 d 換液1 次，保持細胞正常生長，常規消化傳代。

1.2.2 細胞分組 取對數生長期細胞1×105個/ml，接種于細胞培養瓶。參照文獻和細胞學預實驗結果選取藥物濃度及分組，實驗細胞分為5組：①陰性對照組（NC），以無血清DMEM為對照；②陽性對照組（PC）：終濃度100 μmol/L 順鉑；③低濃度組：終濃度40 μmol/L利多卡因；④中濃度組：終濃度400 μmol/L利多卡因；⑤高濃度組：終濃度4 000 μmol/L 利多卡因。以上各組均在無血清培養液中繼續培養6 h［8-9］。

1.2.3 不同濃度利多卡因對細胞增殖的影響 各組細胞處理6 h 后，常規消化細胞，顯微鏡下計數，按照1×104個/100 μl 將細胞接種于96 孔板。加入DMDM 培養液，10%胎牛血清，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養。細胞培養48 h 后，每孔加入10 μl CCK-8 溶液至96 孔板，細胞培養箱內繼續孵育2 h，于入射光波長450 nm處測定吸光度，實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 按1.2.3 方法培養的各組細胞置于細胞培養箱培養48 h，PBS沖洗細胞2次，再將細胞消化成單細胞懸液，收集至10 ml 離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。將細胞重懸于200 μl Binding Buffer。加入10 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI，充分混勻，避光室溫反應15 min，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.5 Western blot 檢 測p-PI3K、p-Akt，Bcl-2 表達 將1.2.3培養的各組細胞置于細胞培養箱繼續培養48 h 后分別收集細胞，提取細胞總蛋白，以GAPDH為內參。BCA定量分別得出樣品蛋白濃度。配制分離膠和濃縮膠，調整蛋白上樣濃度一致，行SDS-PAGE 電泳（110 V，2 h），隨后按1.5 A/cm2選擇恒流半干式轉膜2～2.5 h。將PVDF 膜浸泡在含5%脫脂奶粉的TBST 中，小搖床中封閉1 h 后，加一抗4 ℃孵育過夜，按說明書比例室溫孵育二抗2 h，隨后用凝膠成像儀進行發光并記錄灰度值，蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內參蛋白灰度值。

2 結果

2.1 不同濃度利多卡因對細胞增殖的影響 隨著利多卡因藥物濃度增大，細胞OD 值呈下降趨勢，與對照組相比，利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L 處理組差異具有統計學意義（P<0.05），利多卡因40 μmol/L處理組與對照組相比差異無統計學意義，與順鉑組相比差異具有統計學意義（P<0.05，圖1）。利多卡因中、高濃度組細胞增殖能力降低。

圖1 不同濃度利多卡因作用下細胞A值變化Fig.1 Absorbtance value changes of cells in different doses of lidocaine groups

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 為進一步檢測利多卡因對細胞凋亡的作用效果，采用流式細胞術對其進行具體分析。利多卡因400 μmol/L、4 000 μmol/L處理組與對照組相比凋亡率升高（P<0.05）；利多卡因40 μmol/L、400 μmol/L 處理組與順鉑組相比差異具有統計學意義（P<0.05，表1、圖2）。

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡Fig.2 Detection of cell apoptosis by FCM

表1 各組細胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

表1 各組細胞凋亡率（±s）Tab.1 Apoptosis rates in each group（±s）

Note：Compared with NC group，1）P<0.05；compared with PC group，2）P<0.05.

Apoptosis rate/%9.63±1.52 42.51±1.18 11.35±2.022）17.00±2.021）2）38.25±1.181）Groups NC PC Lidocaine low dose（40 μmol/L）Lidocaine medium dose（400 μmol/L）Lidocaine high dose（4 000 μmol/L）

2.3 不同劑量利多卡因對蛋白表達影響 采用Western blot 檢測各組細胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 蛋白表達變化，與對照組相比，利多卡因低、中、高劑量組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表達降低（P<0.05），且呈劑量依賴性（P<0.05）。利多卡因低、中劑量組p-PI3K、p-Akt、Bcl-2 表達高于順鉑組（P<0.05）；利多卡因高劑量組p-Akt 表達高于順鉑組（P<0.05）；利多卡因高劑量組p-PI3K、Bcl-2表達與順鉑組相比差異無統計學意義（P>0.05），見圖3。

圖3 不同劑量利多卡因對蛋白表達影響Fig.3 Effects of different doses of lidocaine on proteins expressions

3 討論

利多卡因屬于經典的酰胺類麻醉藥，臨床常用于黏膜麻醉、局部皮膚及區域神經阻滯，并有抗炎、抗菌等特殊作用［10-11］。在口腔科各類診療技術中應用非常普遍，主要用于牙體牙髓病、齦下刮治術、三叉神經痛等封閉麻醉以及與其他藥物組成復方用于口腔潰瘍、口腔黏膜炎、口腔單純皰疹治療，療效顯著［12-13］。近年隨著腫瘤發病機制研究不斷深入，研究者逐漸認識到圍術期應用不同麻醉藥物對腫瘤轉移、復發、生存期也存在一定影響，且發現利多卡因這一低細胞毒性、傳統的經濟藥物在腫瘤治療、預防方面具有較好的應用前景［14］。

腫瘤細胞增殖失控是導致腫瘤患者病程進展惡化的主要原因，嚴重威脅腫瘤患者生命。抑制腫瘤細胞迅速增殖是一種有效的抗腫瘤方式，日本學者SAKAGUCHI 等［6］發現利多卡因可抑制人類舌癌細胞株CA127 增殖。該項研究采用利多卡因處理高表達表皮生長因子受體的人舌癌細胞株CA127，證實利多卡因通過抑制EGFR 酪氨酸激酶途徑發揮抗人舌癌細胞增殖作用。本研究證實利多卡因對口腔鱗癌有增殖抑制作用，為局麻藥利多卡因用于口腔腫瘤治療提供了實驗依據。

除抑制腫瘤細胞增殖外，促進腫瘤細胞凋亡也是治療腫瘤的有效策略。目前研究證實利多卡因體外抗腫瘤作用可通過多種途徑促進其凋亡［15］。以上誘導腫瘤細胞凋亡途徑包括去內質網應激途徑、甲基化途徑、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑、類肝素結合樣表皮生長因子（HB-EGF）途徑以及其他非死亡受體途徑等。其中PI3K/Akt 信號通路是一條重要的信號轉導通路，在細胞中起抗凋亡、促進增殖、生存的重要調控作用。該通路在多種腫瘤細胞中均呈過度激活狀態，其過度激活與腫瘤發生、發展、遷移密切相關。P13K 家族參與的眾多信號轉導途徑中，P13K/Akt 信號轉導途徑在凋亡調節中發揮重要作用。

PI3K 是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，當胞外信號與受體酪氨酸激酶或G 蛋白偶聯受體結合后將PI3K 募集到細胞膜，激活PI3K，PI3K 后可磷酸化膜磷脂磷脂酰肌醇PI肌醇環的第3位碳原子參與多種PI 中間體磷酸化，如產生PIP3。PIP3 與細胞內含有PH 結 構 域 的 信 號 蛋 白PDK1（phosphoinositide de?pendent kinase-1）和Akt 結合，促使PDK1 磷酸化Akt而活化Akt。Akt又稱PKB，屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶是PI3K最重要的下游分子。Akt分子上有位于CAT（central kinase catalytic）結構域T308 和調節性疏水結構域的S473 2 個磷酸化位點，發生磷酸化后Akt被完全激活。激活后Akt轉位到細胞漿或細胞核通過改變下游分子磷酸化水平調節細胞功能。PI3K活化的Akt能夠作用于其下游關鍵的凋亡蛋白，如凋亡Bcl-2家族成員BAD、mTOR、eNOS、NF-κB、FOXO、MDM2、CREB、caspase-9 等下游底物分子，發揮其抗凋亡、促生存的生物學效應［16-18］。本研究證實利多卡因可通過抑制PI3K/Akt 途徑，抑制Bcl-2 等抗凋亡蛋白表達發揮促進凋亡作用。細胞內的各種信號通路并不是單一存在的，而是相互交叉形成網絡，PI3K/Akt僅是這些通路中的中心位點之一，還可被EGFR、ras、IRS1、JAK、FAK、c-met 等多種上游分子激活。利多卡因所表現出的抗腫瘤療效仍是值得肯定的，所涉及的凋亡途徑眾多，有待進一步研究。

總之，常用藥利多卡因在腫瘤外科并與化療、放療、生物治療聯合應用，在增效減毒、降低圍手術期應激、減少多因素致腫瘤擴散等方面具有重要應用前景。近年關于在臨床圍術期應用利多卡因降低腫瘤復發率及總體死亡率多有報道，為傳統麻醉藥利多卡因用于腫瘤治療提供了更多新的依據，但利多卡因在抗腫瘤方面涉及的分子機制有待深入研究［19-20］。