孕酮及其受體、IL-8與原因不明自然流產(chǎn)的相關(guān)性研究①

馬銘艷 楊美霞 宮曉玲 趙紫薇 岳淑芬 宋 芳

（包頭醫(yī)學院組織學與胚胎學教研室，包頭 014040）

自然流產(chǎn)病因較多且復(fù)雜，其中70%～80%原因不明。越來越多學者認為自然流產(chǎn)發(fā)生與母胎界面免疫微環(huán)境Th1/Th2 細胞因子失衡有關(guān)。王麗紅等［1］研究發(fā)現(xiàn)，IL-8 是Th1 型細胞因子，其高表達可能與自然流產(chǎn)有關(guān)，但與別川定［2］觀點不同。王巧香［3］研究發(fā)現(xiàn)，孕酮（progesterone，P）可促進Th2 型細胞因子分泌，維持正常妊娠。據(jù)統(tǒng)計，由于P 不足發(fā)生先兆流產(chǎn)患者肌內(nèi)注射黃體酮治療后，仍有部分患者保胎失敗，推測可能與Th1/Th2 細胞因子失衡有關(guān)［4］。本課題組前期動物實驗證明，P可抑制自然流產(chǎn)小鼠母胎界面蛻膜細胞分泌IL-8，維持正常妊娠［5］。但人體存在復(fù)雜的細胞因子網(wǎng)絡(luò)，P不足是否與IL-8 表達相關(guān)尚未見報道。孕酮受體（progesterone receptor，PR）受雌孕激素雙重調(diào)控，與P 特異性結(jié)合發(fā)揮作用。因此，本文通過研究P、PR和IL-8 在自然流產(chǎn)患者外周血及母胎界面的表達情況，揭示其中關(guān)聯(lián)，為進一步探討類固醇激素-蛻膜細胞-細胞因子在自然流產(chǎn)中的調(diào)節(jié)機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研 究 對 象 取2019 年5 月 至2020 年5 月包鋼第三職工醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診，出現(xiàn)少量陰道出血，B 超提示胚胎死亡，需進行清宮的30 例原因不明自然流產(chǎn)患者作為流產(chǎn)組。納入標準：①首次發(fā)生自然流產(chǎn)；②夫妻雙方染色體核型正常，男方精液常規(guī)檢查正常；③患者無生殖道解剖學異常；④無主動免疫治療史。排除標準：遺傳性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、急慢性疾病、血液病、器質(zhì)性病變、不良飲食史、服藥史及年齡≥40 歲患者。隨機選取同期正常早孕婦女30 例作為對照組，無自然流產(chǎn)史，無腹痛、陰道流血等癥狀，自愿行人工流產(chǎn)術(shù)，B 超提示胚胎發(fā)育正常。兩組一般資料差異無統(tǒng)計學意義，具有可比性。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學院倫理委員會審批，所有研究對象知情同意。

1.1.2 主要試劑 P、IL-8 ELISA 試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；兔抗人PR 抗體（英國Abcam公司）；兔抗人IL-8 抗體（美國Santa Cruz 公司）；PV-6000 試劑盒及DAB 顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本收集與處理 所有研究對象均于清晨空腹抽取肘正中靜脈血3 ml，1 h 內(nèi)2 000 r/min 離心10 min，取上清，每人份分裝2 管，-20 ℃保存。流產(chǎn)組和對照組在施行清宮術(shù)時收集絨毛及蛻膜組織，生理鹽水沖洗干凈后Bouin's 液固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊保存。

1.2.2 ELISA 按照ELISA 測定試劑盒說明書，依次在預(yù)包被板中加入標準品或待測樣品（37 ℃、120 min）、生物素化抗體（37 ℃、60 min）、辣根過氧化物酶標記的鏈霉抗生物素蛋白（37 ℃、120 min）、TMB 顯色液37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min，加入終止液混勻，酶標儀檢測450 nm處吸光度。

1.2.3 HE 染色 各蠟塊標本均切為5 μm，常規(guī)脫蠟水化，蘇木素染色3 min，加入1%鹽酸乙醇反應(yīng)5 s，加入氨水反應(yīng)5 s；伊紅染色2 min，乙醇脫水，透明，封片，鏡檢。

1.2.4 免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，EDTA 抗原修復(fù)液微波修復(fù)10 min，加入0.3%H2O2-甲醇室溫孵育10 min，滴加兔抗人PR 抗體（1∶400）、兔抗人IL-8 抗體（1∶200）4 ℃孵育過夜；滴加辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG 抗體室溫孵育20 min，DAB 顯色6～10 min。蘇木素復(fù)染細胞核，常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。PBS 代替一抗作為陰性對照，200 倍光鏡下每張切片選取5 個視野，Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件計算平均光密度值表示PR、IL-8 蛋白相對表達，免疫組織化學染色切片進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以xˉ±s 表示，采用獨立樣本t檢驗；P、PR與IL-8相關(guān)性分析采用Pearson等級相關(guān)性分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 測定 ELISA 結(jié)果顯示，流產(chǎn)組血清P水平明顯低于對照組（P<0.01）；流產(chǎn)組血清IL-8 水平明顯高于對照組（P<0.01，表1）。

表1 兩組血清P、IL-8水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups（±s）

表1 兩組血清P、IL-8水平比較（±s）Tab.1 Comparison of serum P and IL-8 concentrations in two groups（±s）

Note：1）P<0.01 vs control group.

IL-8/（pg·ml-1）1 411.03±256.241）628.45±175.36 Groups Abortion Control P/（nmol·L-1）27.38±3.171）64.21±6.35

2.2 HE 染色 絨毛組織中，流產(chǎn)組絨毛上皮變薄，細胞嗜酸性增強，結(jié)締組織細胞纖維素樣變。對照組絨毛上皮合體滋養(yǎng)層細胞較多，細胞膜界限不清，流產(chǎn)組細胞滋養(yǎng)層細胞界限清晰，絨毛內(nèi)結(jié)締組織細胞呈星芒狀排列（圖1A）。蛻膜組織中，流產(chǎn)組蛻膜細胞失去細胞間連接，細胞質(zhì)嗜酸性增強，對照組蛻膜細胞體積較大，呈砌磚樣緊密排列，細胞界限清晰，細胞核呈圓形或卵圓形，位于細胞中央，著色淺（圖1B）。

圖1 流產(chǎn)組與對照組絨毛組織、蛻膜組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of villi and decidua in abortion group and control group（×200）

2.3 免疫組織化學染色

2.3.1 絨毛和蛻膜中PR 和IL-8 蛋白組織學定位免疫組織化學染色結(jié)果顯示，兩組絨毛組織PR蛋白表達均為陰性，兩組蛻膜組織中PR 均表達于蛻膜細胞的細胞核，呈棕黃色顆粒（圖2A）。兩組絨毛組織中IL-8 均表達于絨毛上皮細胞的細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，兩組蛻膜組織中IL-8 均表達于蛻膜細胞的細胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，各組陽性反應(yīng)均強弱不等（圖2B）。

圖2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8表達（×200）Fig.2 Expressions of PR and IL-8 in villi and decidual tissues in two groups（×200）

2.3.2 PR 和IL-8 免疫組織化學染色半定量分析流產(chǎn)組蛻膜組織中PR 含量明顯低于對照組（P<0.01）。流產(chǎn)組絨毛組織中IL-8 含量明顯高于對照組（P<0.01）。流產(chǎn)組蛻膜組織中IL-8 含量高于對照組（P<0.05，表2）。

表2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8蛋白含量比較（±s）Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups（±s）

表2 兩組絨毛和蛻膜組織中PR、IL-8蛋白含量比較（±s）Tab.2 Comparison of PR and IL-8 protein contents in villi and decidua in two groups（±s）

Note：0. Negative expression；1）P<0.05，2）P<0.01 vs control group.

IL-8 Villi Decidua 0.140±0.0092） 0.164±0.0891）0.131±0.018 0.109±0.063 Groups Abortion Control PR Villi Decidua 0 0.109±0.0172）0 0.148±0.020

2.4 P、PR 與IL-8 相關(guān)性分析 流產(chǎn)組血清P 與IL-8呈顯著負相關(guān)（r=-0.870，P<0.01），流產(chǎn)組蛻膜組織PR 與IL-8 水平呈顯著負相關(guān)（r=-0.650，P<0.01，圖3）。

圖3 相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis

3 討論

自然流產(chǎn)指妊娠<28周、胎兒體重<1 kg、非人為原因?qū)е碌牧鳟a(chǎn)，其病因受到廣泛關(guān)注，母體類固醇激素水平異常、母胎界面Th1/Th2 細胞因子失衡都可能導致自然流產(chǎn)。生殖免疫學認為，正常妊娠以Th2 型細胞為主，當向Th1 型細胞偏離時，Th1 型細胞分泌IL-8、IFN-γ、TNF-α 等促炎因子，抑制Th2型細胞增殖，破壞母胎界面免疫微環(huán)境，引發(fā)流產(chǎn)［6-9］。因此，維持正常免疫平衡是降低流產(chǎn)發(fā)生率的關(guān)鍵。

P 是一種天然孕激素，妊娠早期，黃體分泌大量P，使血清P 含量不斷升高，與Ca2+結(jié)合降低子宮平滑肌興奮性，促進胚泡著床，一定程度防止流產(chǎn)發(fā)生；但黃體功能異常、P 分泌減少則易發(fā)生先兆流產(chǎn)等［10-11］。因此，P 水平對早期妊娠維持十分重要。RAGHUPATHY 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，P可通過抑制淋巴細胞產(chǎn)生Th1 型細胞因子，上調(diào)Th2 型細胞因子表達，維持Th1/Th2 細胞因子平衡。此外，TAN 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，P與A型PR結(jié)合可增強Th1型細胞因子表達，具有殺胚作用，與B 型PR 結(jié)合可降低Th1 型細胞因子表達，對滋養(yǎng)層細胞和胎兒起保護作用。

IL-8 是Th1 型細胞分泌的一種炎癥因子，對中性粒細胞、T 淋巴細胞、嗜堿性粒細胞具有趨化作用，并可激活中性粒細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，還可與TNF-α 等促炎因子共同破壞母胎界面免疫微環(huán)境，促使滋養(yǎng)層細胞凋亡，影響胎盤功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者血清P 水平明顯低于正常妊娠者，與謝雪梅等［14］結(jié)論一致。研究證實，妊娠早期，P 分泌不足，導致子宮平滑肌興奮性增強，易發(fā)生自然流產(chǎn)等。免疫組織化學染色結(jié)果表明，流產(chǎn)組蛻膜組織中PR 含量明顯低于對照組，與李新菊［15］研究結(jié)論一致。正常妊娠時，P 與PR 特異性結(jié)合，促進子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為蛻膜細胞，為胚胎發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持妊娠；PR表達減少，影響P 生理功能，增強子宮平滑肌興奮性，使蛻膜組織發(fā)生不同程度凋亡、壞死，引發(fā)流產(chǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，自然流產(chǎn)患者血清、絨毛和蛻膜組織中IL-8 水平明顯高于正常妊娠者，與許云霞［16］研究結(jié)論一致。原因可能為絨毛和蛻膜組織中的免疫細胞被激活，釋放IL-8、TNF-α 等促炎因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，同時損傷胎兒胎盤組織，引發(fā)自然流產(chǎn)。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，P 與IL-8 以及PR 與IL-8均呈負相關(guān)，提示P、PR 可能對IL-8 具有一定抑制作用，從而減少母胎界面炎癥因子釋放、淋巴細胞活化，使胚胎免受母體免疫系統(tǒng)殺傷，減少中性粒細胞侵入蛻膜組織，從而維持正常妊娠。HORIE等［17］通過研究子宮內(nèi)膜異位癥患者基質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)P 可通過抑制NF-κB 信號通路下調(diào)IL-8 表達。P 通過哪種信號途徑調(diào)節(jié)自然流產(chǎn)患者IL-8 表達尚無文獻報道。

綜上所述，P、PR 低表達、IL-8 高表達均可能引發(fā)自然流產(chǎn)，且P、PR 可能對IL-8 有一定抑制作用。因此，進一步從類固醇激素-蛻膜細胞-細胞因子網(wǎng)絡(luò)揭示P下調(diào)IL-8表達的分子機制可為早期自然流產(chǎn)防治提供理論依據(jù)。