Th22及其分泌的細胞因子在變應(yīng)性鼻炎患者外周血中的表達①

黎 爽 陳 慧 張慧云 何韶衡 陳 冬

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，錦州 121000）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）也稱過敏性鼻炎，是易感個體接觸變應(yīng)原后，主要由一種與免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的以發(fā)作性噴嚏、流涕和鼻塞為主要癥狀的鼻黏膜變態(tài)反應(yīng)性疾病［1］。目前，AR 已成為全球性健康問題，可直接影響患者的工作生活及身心健康［2-3］。AR 是上呼吸道常見非特異性炎癥，在發(fā)達國家及發(fā)展中國家的發(fā)病率有所提高［4］。研究顯示，Th1/Th2、Th17/Treg 免疫失衡可引發(fā)AR，但其具體發(fā)病機制尚不明確，可能還有其他細胞及細胞因子參與其發(fā)病［5-6］。Th22 是一種新型輔助性T 細胞（helper T cells，Th）亞群，主要由朗格漢斯細胞和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）誘導(dǎo)分化而來［7］。Th22 的功能主要通過IL-22 實現(xiàn)［7］。IL-22 屬于α-螺旋蛋白的一種類型［8］。IL-22 是IL-10 細胞因子家族成員［9］。近年有研究表明，哮喘患者外周血中Th22 比例及IL-22 表達升高［10］。但目前在AR 中關(guān)于Th22 和IL-22 作用的研究甚少。TNF-α 是一種炎癥刺激因子，有文獻顯示其可促進Th22 生成［7］。但其在AR 中的作用尚不清楚。本研究采用ELISA法檢測IL-22 的表達，熒光免疫流式細胞術(shù)檢測Th22 比例及AR 患者外周血TNF-α 對Th22 比例的影響及意義，為AR的發(fā)病機制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 主要試劑及儀器 高速離心機購自美國Thermo 公司；微量移液器購自德國Brand 公司；流式細胞分析儀購自美國BD公司；PE anti-human IL-22、Percp-Cy5.5 anti-human CD3、FITC anti-human CD8、佛波酯（PMA）、Human IL-22 ELISA Kit 均購自美國Biolegend 公司；Human TNF-α 購自美國PeproTech公司。

1.1.2 研究對象 選擇的實驗對象為招募的健康志愿者和在錦醫(yī)大附一院變態(tài)反應(yīng)科門診就診的患者。選取的時間為2020 年1 月至2021 年1 月。本試驗經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準（KYLL 202060）。將2015 年“變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南”［11］作為分組標準，將實驗研究對象分為變應(yīng)性鼻炎組（AR 組）和健康對照組（HCs 組）。AR 組和HCs 組各30 例。排除標準：排除近期服用過影響免疫系統(tǒng)藥物的患者，排除除AR 外的其他過敏性疾病、免疫性、炎癥性疾病等的患者。所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ELISA 檢測IL-22 表達水平 將2 ml靜脈血分離提取血清，按照IL-22試劑盒說明書操作。

1.2.2 流式細胞術(shù)檢測外周血中Th22比例 分離3 ml外周血提取PBMC，1 500 r/min離心10 min，PBS洗滌細胞2 次，重懸于RPMI1640 培養(yǎng)液中，將PBMCs 懸液染色，加入24 孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，3 ml PMA 孵育4 h，流式管中加入1 ml 細胞懸液進行離心處理（2 000 r/min 離心8 min），棄上清，PBS 洗滌2 次。在收集的細胞內(nèi)依次加入CD8-FITC 單抗和CD3-PERCP 單抗，混勻后避光孵育20 min。將洗滌后的細胞懸液用試劑進行固定和破膜。將經(jīng)過2次PBS 洗滌的細胞懸液平均分為2 管，即實驗組和同型對照組。將IL-22-PE 加入實驗管，同型對照抗體加入同型對照管：PE-Mouse IgG2a，k 各10 μl，避光孵育30 min 后應(yīng)用PBS 洗滌2 次，然后加入PBS（500 μl）重懸，流式上機檢測。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測TNF-α 刺激對AR 患者外周血Th22比例的影響 分別吸取100 μl AR 患者外周血的PBMC懸液至空白對照組、TNF-α處理組（以下稱為實驗刺激組）和同型對照組，并編號。每管加入3 μl PMA，實驗組再加入TNF-α（終濃度為100 ng/ml），37 ℃避光孵育5 h，PBS 清洗后以1 200 r/min 離心6 min，棄上清。在收集的細胞內(nèi)依次加入CD8-FITC單抗和CD3-PERCP 單抗，混勻后避光孵育20 min。將洗滌后的細胞懸液用試劑進行固定和破膜。將破膜后的懸液經(jīng)PBS洗滌2次后平均分成3管：空白對照組、實驗刺激組、同型對照組。實驗刺激管和空白管加入IL-22-PE，同型對照管加入同型對照抗體：PE-Mouse IgG2a，k 各10 μl，避光孵育30 min 后BS 洗滌2 次，然后加入PBS（500 μl）重懸。流式上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。運用±s表示實驗數(shù)據(jù)，以χ2檢驗、兩個獨立樣本t檢驗、Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗分析實驗數(shù)據(jù)；P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。運用GraphPad Prism（version 6.0）分析箱式統(tǒng)計圖；運用Flowjo（version 7.6）軟件分析流式數(shù)據(jù)及代表圖。

2 結(jié)果

2.1 AR 組與HCs 組的臨床資料比較 AR 組（n=30）與HCs 組（n=30）在年齡和性別方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

表1 研究對象的臨床資料（n=30）Tab.1 Clinical data of study subjects（n=30）

2.2 HCs 組與AR 患者組IL-22 表達水平比較ELISA 實驗結(jié)果顯示，與HCs 外周血中IL-22 水平［（57.31±31.34）pg/ml］相比，AR 患者外周血中IL-22 水平［（201.12±57.44）pg/ml］顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 AR 組HCs 組外周血中Th22 比例變化 運用BD FACS Verse 流式細胞儀檢測AR 組患者和HCs組外周血Th22 比例（Th22 設(shè)門方法見圖1）。結(jié)果顯示，與HCs 組外周血CD4+T 細胞中Th22 的比例［（0.81±0.09）%，圖1D］相比，AR 組患者外周血CD4+T 細胞中Th22 比例［（3.62±0.74）%，圖1E］顯著升高（P<0.05）。

圖1 Th22的設(shè)門方法Fig.1 Th22 gate method

2.4 AR 患者組與HCs 組外周血中Th22、IL-22 的相關(guān)性分析 AR 組中IL-22 表達水平與Th22 比例呈正相關(guān)；HCs 組中IL-22 表達水平與Th22 比例呈正相關(guān)，見圖2。

圖2 AR患者組、HCs對照組中Th22、IL-22的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of Th22 and IL-22 in AR patients group and HCs control group

2.5 AR 患者外周血與TNF-α 刺激后Th22 比例比較 AR 患者外周血實驗刺激組Th22 比例［（4.63±0.59）%］與空白對照組［（3.62±0.74）%］相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，圖3）。本實驗采用BD FACS Verse 流式細胞儀標記AR 患者外周血Th22的表達，PE IL-22設(shè)門方法見圖4。

圖3 AR 患者外周血中TNF-α 刺激劑對Th22 表達影響的流式代表圖Fig.3 Representative flow chart of effect of TNF-α stimu?lators on Th22 expression in peripheral blood of AR patients

圖4 AR患者外周血Th22的標記方法Fig.4 Marking method of Th22 in peripheral blood of AR patients

3 討論

目前普遍認為AR 屬于Ⅰ型超敏反應(yīng)，其發(fā)生機制可分為致敏和效應(yīng)激發(fā)兩個階段。當(dāng)鼻腔黏膜與變應(yīng)原接觸后，變應(yīng)原可被鼻黏膜中的抗原呈遞細胞（antiqen presenting cell，APC）捕獲加工，使得T 細胞分化向Th2 偏移，即Th2 數(shù)量增多。Th2 分泌的IL-4可作用于B細胞并使其轉(zhuǎn)換變成漿細胞進而產(chǎn)生IgE。IgE 在肥大細胞或嗜堿性粒細胞表面的受體Fc?RⅠ和Fc?RⅡ結(jié)合并釋放炎癥介質(zhì)，此為致敏階段。當(dāng)變應(yīng)原再次進入鼻腔時，引起AR的臨床癥狀以及鼻腔黏膜的炎癥反應(yīng)，這一階段為激發(fā)階段［12］。

人體的免疫調(diào)節(jié)細胞之一是Th。Th 在受到不同刺激誘導(dǎo)下可分化成不同的細胞亞群。每個Th亞群都會釋放不同的細胞因子，參與其對應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，使機體保持動態(tài)平衡。由DUHEN 等［13］和TRIFARL 等［14］的報道中得知，他們發(fā)現(xiàn)了一種與皮膚免疫功能相關(guān)的新的Th，其發(fā)揮生物學(xué)作用主要通過IL-22 實現(xiàn)。因此科學(xué)家將其命名為Th22。Th22 主要通過分泌特征性細胞因子IL-22 在自身免疫性疾病、肝臟疾病、炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)等的發(fā)病、發(fā)展過程發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用［7］。IL-22 是一種α-螺旋蛋白，其依靠細胞因子受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［8］。

實驗結(jié)果顯示Th22 比例及IL-22 表達水平在AR 患者外周血中含量高于HCs，且兩者呈正相關(guān)。有文獻報道，與健康人群相比，IL-22 在哮喘患者血清和痰液中表達明顯增高［15］。還有研究顯示哮喘患者病情程度與血清和痰標本中IL-22 的表達水平呈正相關(guān)［16］。過敏性皮炎患者皮膚中Th22 比例高于HCs［17-18］。在小兒哮喘患者中IL-22 mRNA 水平和血清中總IgE水平呈正相關(guān)，且IL-22 mRNA 水平會隨著病情加重而升高［19］。還有動物實驗顯示，IL-22 在被卵白蛋白（ovalbumin，OVA）致敏的小鼠肺組織和血清中的表達顯著增加［15］。這些都反映出IL-22 和過敏性疾病之間的關(guān)系，與本實驗結(jié)果相符。根據(jù)“哮喘和AR 具有相似性”在研究者間的普遍認識［11，20］，課題組推測可能是過敏原刺激后促進CD4+細胞分化成Th22 并釋放特征性細胞因子IL-22 進而參與過敏性疾病的發(fā)生和發(fā)展。Th22 細及其分泌的特征性細胞因子IL-22 在AR 和哮喘中發(fā)揮促炎作用。

Th22 的表面特征性識別因子為CC 趨化因子受體10、CC 趨化因子受體6 和CC 趨化因子受體4，主要轉(zhuǎn)錄因子為AhR［7］。Th22 和IL-22 在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮免疫應(yīng)答作用［9］。有文獻顯示，IL-22在炎癥反應(yīng)中可發(fā)揮抗炎及促炎雙重作用［21］。課題組分析Th22 與疾病間的作用主要是通過對IL-22的研究［22］。結(jié)合卵清蛋白致敏AR鼠單細胞懸液中Th22及其分泌的特征性細胞因子IL-22的表達水平升高的報道［23］。有研究者認為IL-22 通過與非免疫細胞上特異性受體（如氣道上皮細胞和氣道平滑肌細胞等）結(jié)合，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）、STAT1、STAT5 等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在哮喘的發(fā)病過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［24-26］。ALKHOURI等［27］認為趨化因子配體10［chemokine（CXC motif）ligand 10，CXCL10］可促進人肺部肥大細胞產(chǎn)生。也有研究者認為IL-22 參與AR 的發(fā)生是因為其提高了IFN-γ 誘導(dǎo)的CXCL10 的表達［28］。在動物實驗中，將小鼠制備成被OVA 致敏的IL-22 缺失的動物模型，發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞在其支氣管肺泡灌洗液及肺組織中的數(shù)量減少，且白細胞浸潤及IL-13、IL-5及IL-33 在其呼吸道組織中的表達也均出現(xiàn)降低現(xiàn)象。提示IL-22 是人和動物的誘導(dǎo)炎癥分子之一。IL-22 的缺乏可引起呼吸道過敏反應(yīng)的抑制作用。此外，OVA 抗原刺激后敲除IL-22 基因的小鼠中，Th2 分泌細胞因子及中性粒細胞、嗜酸性粒細胞的水平降低，表明這些都可能是誘導(dǎo)促炎介質(zhì)促進呼吸道炎癥發(fā)生發(fā)展的原因［15，29］。

本研究結(jié)果顯示，在AR 患者外周血中，與空白對照組相比，實驗刺激組中Th22比例明顯增加。文獻顯示Th22 及IL-22 水平在活動性RA 患者外周血中明顯高于健康對照人群，其廣泛存在于組織細胞中［30］。NF-κB可負責(zé)調(diào)控多種炎癥介質(zhì)和細胞因子等的基因表達，并參與免疫炎癥反應(yīng)。有資料顯示，激活單核巨噬細胞可產(chǎn)生TNF-α［31-32］。TNF-α作為一種炎癥介質(zhì)，可導(dǎo)致一系列病理生理反應(yīng)，包括呼吸道的氣道痙攣、水腫，提高血管的通透性和小血栓的產(chǎn)生等，并可誘發(fā)、加重哮喘的發(fā)作［33］。有文獻報道，TNF-α可促進Th22的生成［7，34-35］。結(jié)合資料，TNF-α 可能是變應(yīng)性炎癥發(fā)生發(fā)展的啟動和加速因子之一。研究顯示，在免疫失衡疾病中，TNF-α、NF-κB、Th22 均增多［36-37］。課題組猜測在AR患者中，TNF-α 可能通過NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)典通路與非經(jīng)典通路刺激產(chǎn)生Th22，此猜測有待進一步的研究證實。