SH-6聯合CHKA基因沉默對膠質瘤細胞增殖及侵襲的影響①

黃 靈 鄒有瑞 李琢琦 岳芳倩 馬 輝 （寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川 750004）

膠質瘤是中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤之一，約占中樞神經系統原發性惡性腫瘤的80%［1-2］。近年來，雖然醫療技術發展迅速，但膠質瘤治療的主要方式仍然停留在手術切除輔助放化療階段，即便是采取了先進的綜合治療措施，患者仍然容易出現復發、耐藥、轉移［3］。膽堿激酶α（cho?line kinase alpha，CHKA）在肯尼迪途徑中是一種將游離膽堿磷酸化為磷酸膽堿的酶［4］。膽堿是合成磷脂所必需的底物，磷脂酰膽堿是膜和底物的主要磷脂成分之一，同時也是細胞大量增殖和合成脂質信號分子的基本底物；研究發現在腫瘤細胞內磷酸膽堿的濃度明顯增高［5］。磷酸膽堿是細胞內維持磷脂酸產生所必需的；磷脂酸是磷脂酶D2裂解磷脂酰膽堿產生的代謝產物之一，同時也是磷脂酰肌醇3-激酶PI3K/AKT 存活信號通路的關鍵激活因子［6］。與此同時，腫瘤內部各信號通路及各個代謝通路之間存在錯綜復雜的相互作用。這就是臨床上在使用單一藥物抗腫瘤時，腫瘤可在較短的時間內對藥物形成耐受的原因。正是這些錯綜復雜的因素使得科研和抗腫瘤臨床藥物治療都變得極其困難和復雜。這些綜合性因素提示無論是在科研，還是在臨床上采用單一的藥物抗腫瘤的效果可能不理想。基于此，本研究通過利用新型AKT抑制劑SH-6聯合慢病毒沉默CHKA基因在體內外干預腦膠質瘤細胞并探討影響膠質瘤生長的作用機制，為今后膠質瘤聯合靶向藥物治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 U87細胞購自中科院上海細胞庫；兔抗人CHKA、AKT、GAPDH、p-AKT、PI3K、p-PI3K 蛋白抗體購自Abcam 公司；二抗購自北京中橋生物科技公司；多聚甲醛（4%）購自上海索萊寶公司；DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Gibco 公司；胰蛋白酶、結晶紫和雙抗購自上海碧云天有限公司；二幸可寧酸（bicinchoinic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自江蘇凱基公司；Transwell 小室購自康寧公司；基質膠購自BD 公司；CCK-8 細胞凋亡及細胞周期檢測試劑盒購自同仁公司；DMSO 購自MP生物醫療公司；電泳儀、轉膜儀購自Bio-Rad 公司；CHKA 沉默慢病毒及其對照組慢病毒購自北京合生基因生化技術有限公司；實驗用裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于寧夏醫科大學實驗動物中心，體質量250～320 g，日齡21～34 d，SPF級BALB/c 雌性大鼠，許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 37 ℃水浴鍋內迅速復蘇膠質瘤U87細胞，將凍存管經消毒后置于超凈工作臺中，向凍存管中加入1 ml 培養基并離心500 r/min，5 min，棄上清。加入5 ml DMEM（含5%FBS）培養基后，將細胞與培養基混勻后轉移至T25培養瓶中做“井”字形晃動使腫瘤細胞均勻鋪于瓶內，置于37 ℃、5%CO2恒溫恒濕培養箱內培養。待細胞長至總體積約80%時，加入不含EDTA 胰蛋白酶消化并傳代。待傳3～5 代膠質瘤細胞穩定后，取適量膠質瘤細胞進行后續實驗。

1.2.2 慢病毒轉染 取對數生長期的U87 細胞以2×106個/孔接種于6 孔板，培養24 h 貼壁后，根據慢病毒使用說明書，分別向6 孔板中加入1 ml 含20μl CHKA 沉默慢病毒及對照組慢病毒。放入培養箱中繼續培養12 h。更換培養基，繼續培養48 h后，使用熒光顯微鏡觀察慢病毒熒光在膠質瘤細胞中的表達情況；若轉染后表達慢病毒熒光的膠質瘤細胞數占未表達細胞數的80%以上，則可進行后續實驗。若轉染上熒光的細胞小于80%，則需要用嘌呤霉素對膠質瘤細胞進行篩選后進行后續實驗。

1.2.3 腫瘤細胞體內外分組 慢病毒轉染成功，可進行后續實驗。體外實驗分組：①Control 組：該組培養未感染慢病毒的膠質瘤細胞；②shNC 組：在該組中培養轉染有對照慢病毒的U87 細胞；③SH-6組：向該組培養未感染慢病毒的U87 細胞中加入SH-6 溶液（10 μmol/ml）進行干預處理；④shCHKASH-6 組，即轉染CHKA 沉默慢病毒12 h 后向該組中加入SH-6溶液。

體內實驗分組：①DMSO 組：向該組裸鼠移植未感染慢病毒的U87 細胞100μl 后，使用DMSO 10μl對腫瘤進行干預處理；②shNC 組：向該組裸鼠移植轉染有對照慢病毒的U87細胞100μl；③SH-6組：在該組裸鼠皮下移植未感染慢病毒的U87細胞100μl后，使用SH-6 10 μl 對腫瘤進行干預治療；④shCHKASH-6 組：向該組裸鼠中移植有沉默慢病毒轉染的U87 細胞，同時使用SH-6 10 μl 對腫瘤進行干預治療。其中每組各6 只裸鼠。待腫瘤長到5～10 mm3時，DMSO組只用DMSO 10μl干預處理；shNC組不予任何處理；SH-6 組及shCHKA-SH-6 組用SH-6 10 μl進行治療，每組均干預治療3 d/次。稱量各組裸鼠體質量及測量膠質瘤的長徑（L）及寬徑（W），腫瘤體積（V）=（LW2）/2，經測量后計算各組腫瘤大小（mm3）及體質量的平均值，繪制腫瘤在30 d 內的生長曲線并統計分析。

1.2.4 CCK-8 法檢測U87 細胞的增殖能力 用胰蛋白酶將貼壁細胞從培養瓶壁上消化使其脫落并制成單細胞懸液，用培養基稀釋至細胞數為3×102個/ml。向96 孔板中加入100 μl 細胞懸液，每組設置3個復孔，置于37 ℃、5%CO2濕式培養箱培養貼壁，分別在24 h、48 h、72 h 時向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，繼續培養2 h。使用酶標儀檢測不同時間點在450 nm處的OD值進行數據統計分析。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞周期 用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁的U87 細胞重懸成單細胞懸液，收集適量的單細胞懸液到1.5 ml EP 管內，向每管中加入約0.5 ml 預冷染色緩沖液，重懸細胞并重復1 次。1 000 r/min 離心3～5 min。棄上清，加入0.5 ml 培養基重懸細胞。最后加入4 μl 的Red NucleusⅠ染色液，緩慢并充分混勻，在避光常溫條件下孵育20 min后上機檢測。

1.2.6 流式檢測細胞凋亡 用不含EDTA 的胰蛋白酶消化并收集貼壁的U87 細胞，PBS 清洗2 遍，棄上清，在冰浴條件下加入5μl Annexin V-PE 和10μl 7-AAD并輕柔混勻，上機檢測并分析。

1.2.7 Transwell 實驗檢測U87 細胞侵襲能力 將基質膠（Matrigel）按試劑盒說明以1∶8 的比例稀釋。向小室上室加入50μl稀釋過的基質膠，置于4 ℃冰箱晾干（無菌條件）。取2×105個/ml細胞懸液200μl于小室上室，下室加入正常培養基，培養24 h。取出小室，用棉簽擦去小室上室中的細胞和基質膠，多聚甲醛（40 g/L）固定30 min；0.1%結晶紫溶液染色10 min后，用顯微鏡觀察不同視野下的細胞并計數。

1.2.8 腫瘤組織免疫化學染色 第30 天時，頸椎脫臼法處死裸鼠，用無菌剪刀剪開皮膚，鑷子小心取出各組膠質瘤組織，去除周圍脂肪并剪至適量大小，置于4%多聚甲醛中固定24 h。進行包埋、切片、在72 ℃恒溫箱中烘烤2 h，脫蠟及抗原修復之后，封閉2 h，加入相應的一抗并孵育2 h，加抗體增強液20 min 后，依次加二抗，約30 min 后，加入DAB顯色液及蘇木素常規復染后，進行常規封片，干燥后顯微鏡下觀察。

1.2.9 Western blot 檢測相關蛋白 提取膠質瘤細胞及腫瘤組織總蛋白，用BCA 法檢測總蛋白的濃度。以30μg/孔的上樣量進行SDS-PAGE 電泳分離蛋白質，將凝膠上分離的蛋白在270 mA、2 h 條件下轉至PVDF 膜上，封閉2 h。用PBST清洗3遍。加入一抗（1∶1 000）、兔抗人GAPDH 抗體（1∶5 000），4 ℃搖床上過夜；第2 天，PBST 清洗3 遍，加入相應種屬的二抗室溫下孵育1 h；用PBST清洗后，使用ECL發光液曝光，檢測蛋白條帶的吸光度（A）值。CHKA相對表達量=ACHKA/AGAPDH。

1.3 統計學處理 數據分析處理采用Capture 2.1、Image Lab 和GraphPad Prism 8 軟件。組間比較使用t檢驗，數據統計結果以±s表示。多個樣本間比較用單因素方差分析，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 聯合治療抑制U87細胞增殖能力 根據CCK-8在450 nm 處A 值可以得出，與Control 組、shNC 組、SH-6 組相比，shCHKA-SH-6 組細胞在24 h、48 h 及72 h 的增殖速度明顯降低（P<0.05），而Control 組、shNC 組、SH-6 組基本保持同步增加，組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖1。

圖1 U87細胞增殖能力變化Fig.1 Changes in proliferation ability of U87 cells

2.2 聯合治療對U87 細胞周期的影響 結果顯示各組細胞G2期細胞的占比分別為：shCHKA-SH-6 組（27.5±0.3）% 、Control 組（4.3±3.2）% 、shNC 組（9.4±0.7）%、SH-6 組（10.9±0.4）%，shCHKA-SH-6組處于G2期的細胞數量明顯增多（P<0.05），結果表明：SH-6 聯合CHKA 基因干擾表達能夠使細胞停滯在G2期并抑制細胞增殖。見圖2。

圖2 各組細胞周期占比情況及統計結果Fig.2 Cell cycle situation and statistical results of eachgroup

2.3 SH-6 聯合下調CHKA 促進細胞凋亡 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率分別為：Control 組（1.90±0.04%）、shNC 組（4.90±0.04）%、SH-6 組（8.80±0.06）%、shCHKA-SH-6 組（12.80±0.10）%。提示SH-6 聯合下調CHKA 能誘導凋亡，差異具有統計學意義（P<0.05）。見圖3。

圖3 各組細胞凋亡結果及統計分析Fig.3 Apoptosis results and statistical analysis of each group

2.4 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力 各組穿透的細胞數分別為：shCHKA-SH-6組（449.3±17.5）個、Control 組（1 359.0±33.3）個、shNC 組（1 353.0±35.4）個、SH-6 組（877.3±21.5）個，shCHKA-SH-6 組與其他3 組相比，差異具有統計學意義（P<0.01）。見圖4。

圖4 Transwell實驗結果及統計分析（結晶紫染色，×100）Fig.4 Transwell experimental results and statistical analysis（Crystal violet dyeing，×100）

2.5 腫瘤體積生長情況 經過計算各組腫瘤平均體積分別為：DMSO 組（710.2±109.7）mm3、shNC 組（722.9±112.1）mm3、SH-6 組（500.7±67.7）mm3、sh-CHKA-SH-6組（211.7±25.9）mm3。結合圖片及計算結果可知：shCHKA-SH-6 組皮下腫瘤體積明顯小于其他3 組，差異有統計學意義（P<0.05），表明SH-6聯合CHKA 基因沉默在體內能明顯抑制腫瘤的生長。見圖5、圖6。

圖5 腫瘤組織在體內生長情況Fig.5 Growth of tumor tissue in vivo

圖6 腫瘤組織體內生長曲線Fig.6 In vivo growth curve of tumor tissue

2.6 免疫組化檢測結果 免疫組化結果顯示：與DMSO 組、shNC 組、SH-6 組相比，shCHKA-SH-6 組膠質瘤組織中CHKA、PI3K/AKT 通路中關鍵蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），這表明SH-6聯合CHKA基因沉默能有效抑制膠質瘤中CHKA、PI3K/AKT 信號通路中相關蛋白的表達。另外，在SH-6 組中CHKA蛋白表達量比其他3 組高（P<0.05），這說明使用SH-6 能夠抑制PI3K/AKT 信號通路中相關蛋白表達的同時，PI3K/AKT通路中相關蛋白的降低不會反饋性地抑制CHKA的表達。見圖7。

圖7 各組CHKA、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K 免疫組化染色及統計情況Fig.7 CHKA，AKT，p-AKT，PI3K，p-PI3K immunohisto?chemical stainings and statistical analysis of each group

2.7 Western blot 檢測各組細胞蛋白表達情況

2.7.1 體外實驗Western blot 實驗結果顯示：與Control組、shNC組、DMSO組、SH-6組相比，shCHKASH-6組膠質瘤組織中CHKA、PI3K/AKT 通路中相關蛋白表達水平明顯降低（P<0.05）；在SH-6組中，PI3K/AKT 通路中相關蛋白表達量降低，而CHKA 的表達量不受通路抑制劑SH-6的影響（P>0.05）。見圖8。

圖8 CHKA 對U87 細胞PI3K/AKT 通路蛋白表達水平的影響及統計結果Fig.8 Effect of CHKA on expression levels of PI3K/AKT pathway proteins in U87 cells and statistical results

2.7.2 體內實驗Western blot 實驗結果顯示：shCHKA-SH-6 組膠質瘤組織中CHKA、PI3K/AKT 通路中關鍵蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），這與體外實驗結果相一致；在SH-6 組中，CHKA 蛋白的表達與其他蛋白相比差異無統計學意義（P>0.05）。結果表明CHKA 通過能夠抑制PI3K/AKT 信號通路促進膠質瘤生長、轉移等生物學功能。見圖9。

圖9 腫瘤組織中CHKA、PI3K、AKT、p-PI3K、p-AKT蛋白表達及統計情況Fig.9 Expressions and statistical analysis of CHKA，PI3K，AKT，p-PI3K and p-AKT in tumor tissues

3 討論

膠質瘤發生發展與多種因素有關，如NOK、CMTM6、促血管生成因子等，這些綜合性因素導致膠質瘤有較強的侵襲性和轉移性，同時也是導致患者預后不良的主要原因［7-10］。因此，在保護正常腦組織的前提下，如何最大程度地診斷腫瘤的邊界和徹底切除膠質瘤成為當前研究重點。核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）是常用的診斷腦膠質瘤的輔助檢查，但卻不能明確診斷腫瘤邊界及腫瘤邊界處腫瘤細胞代謝物的變化情況，因此MRI在腦部腫瘤的邊界具有一定的局限性。然而，多體素1H-MRS 的出現就彌補了MRI 的這一不足，它能夠無創性地檢測并分析膠質瘤及腦組織之間具有差異的代謝物，利用該代謝物［如：膽堿/肌酸（Cho/Cr）］的差異來評估和明確腫瘤的邊界，該診斷能夠從分子水平上對腫瘤的邊界進行診斷，有望成為MRI 的有力補充［11-14］。本課題組在前期實驗研究中發現：Cho/Cr在膠質瘤細胞中明顯高于正常腦組織，因此使用多體素1H-MRS 作為輔助指導切除膠質瘤可以更加有效地切除腦膠質瘤，能夠明顯改善患者的預后和提高生活質量［15-16］。

CHKA 是在肯尼迪代謝通路中參與膽堿代謝的第一個關鍵酶，并調節磷脂酰膽堿（PC）合成。磷脂酰膽堿是腫瘤細胞膜重要組成部分之一，主要通過該代謝途徑從頭合成，此外，膽堿代謝后生成的產物及催化酶本身對腫瘤細胞的生長起到正反饋作用［17-18］。因此，CHKA 基因被認為是新的癌基因產物。PI3K/AKT（磷脂酰肌醇-3 激酶/蛋白激酶B）信號通路由磷酸化磷脂酰肌醇3羥基的脂類激酶活性PI3K 及下游AKT 組成，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。研究表明，AKT 致癌基因的激活可促進細胞轉化，并影響腫瘤的發生發展［19-20］。因此，AKT 被認為是有效的藥物干預靶點［21］。在經過幾十年AKT 抑制劑合成及大量的臨床試驗，如Perifosine、GSK2110183和RX-0201進入了Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗。這些臨床試驗證明，合成的磷脂酰肌醇磷酸酯（PIA）類似物能有效阻斷腫瘤細胞中的AKT 活性［22-23］。因此，本研究使用了最新人工合成的磷脂酰肌醇磷酸類似物（SH-6），因為SH-6 在肌醇環的第三位缺失羥基，并且有能夠修飾的脂肪族側鏈，具有更高的代謝穩定性。經過體內外實驗證明，通過SH-6 聯合CHKA基因敲除策略能夠使CHKA 表達降低干擾AKT 的激活，從而誘導細胞凋亡，使腫瘤細胞停滯在G2期并抑制腫瘤細胞生長，增殖能力下降，凋亡增加，作為一種重要的凋亡信號通路，PI3K/AKT在抑制膠質瘤細胞凋亡和促進細胞增殖中發揮重要作用，這一機制有可能與阻止AKT 與磷脂酰肌醇結合有關［24］，但是只使用SH-6 干預膠質瘤細胞時卻發現，PI3K/AKT信號通路中關鍵因子減少的同時CHKA卻無明顯變化，這一現象說明CHKA對PI3K/AKT信號通路的調控可能是單向性的，PI3K/AKT 信號通路對CH?KA并無負反饋作用。

綜上所述，CHKA 通過調控PI3K/AKT 信號通路中的關鍵信號分子在膠質瘤細胞中的表達，從而抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，增加細胞凋亡等生物學功能。通過實驗證明CHKA 與PI3K/AKT信號通路在膠質瘤的發生和發展中具有相互作用。CHKA 的敲低至少能夠通過PI3K/AKT 信號通路的失活抑制人腦膠質瘤細胞的增殖和侵襲，這為人腦膠質瘤的精準靶向治療提供了一定的分子依據及理論基礎。