miR-125b對過敏原刺激后支氣管上皮細胞凋亡和分泌炎癥因子的作用

肖惠玲 李艷紅 趙 申 李俊杰 （湖北文理學院附屬醫院，襄陽市中心醫院兒科，襄陽 441000）

支氣管哮喘是一種十分常見的呼吸系統炎癥性疾病，不同患者哮喘嚴重程度差距明顯，目前臨床上用于哮喘治療的藥物主要是糖皮質激素等，部分患者經這些藥物治療后癥狀明顯改善，但有些患者出現激素抵抗，治療效果不佳現象［1］。免疫-炎癥反應、支氣管上皮細胞過度凋亡等是目前公認的哮喘發病機制［2］。近年來，哮喘已被證實是由多種基因調控引起，且分子靶向治療也成為哮喘治療的潛在途徑［3］。miRNA 的長度為20～24 nt，是一種內源性的小分子RNA，沒有編碼蛋白質的作用，其主要通過影響下游靶基因和信號通路發揮作用［4］。miRNA不僅與胚胎發育和機體穩態維持有關，還與炎癥、細胞凋亡、細胞生長、腫瘤等進程關系密切［5］。miR-125b 為miR-125 家族成員，也是miR-125 家族中較為活躍的成員，miR-125b 在腫瘤、腦梗死、阿爾茨海默病等進展中發揮調控作用［6］。既往研究顯示，miR-125b 與哮喘有關，在哮喘患者中發現miR-125b表達下調，且上調miR-125b能夠抑制塵螨誘導的哮喘小鼠氣道炎癥［7］。現階段仍不明確miR-125b在過敏原刺激后支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌中的作用。有研究發現，miR-125b 抵抗骨關節炎軟骨細胞炎癥分泌與下調NF-κB 信號有關［8］。NF-κB 信號通路在人體組織中廣泛存在，是典型的炎癥反應樞紐，其激活能夠誘導下游炎癥因子釋放，促進炎癥反應［9］。另外，NF-κB 還參與調控細胞凋亡過程，是一個多功能信號通路［10］。本實驗以塵螨抗原提取物刺激支氣管上皮細胞系16HBE 進行體外研究，探討miR-125b 在哮喘支氣管上皮細胞凋亡和分泌炎癥因子中的作用和可能機制，為分子靶向治療哮喘提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 支氣管上皮細胞系16HBE 購自通派（上海）生物科技有限公司；mimics control、miR-125b mimics購自百奧邁科生物技術有限公司；Lipo?fectamine2000 試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；Bax 抗體、p65 抗體購自美國Santa Cruz；Bcl-2抗體購自美國BioVision；IL-29檢測試劑盒購自美國Abcam；IL-6 檢測試劑盒購自美國Cayman Chemical；塵螨抗原提取物（安脫達）購自丹麥ALK-Abello A/S。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染處理 支氣管上皮細胞接種于6 孔板，以不含青鏈霉素的細胞培養液培養，24 h 后觀察細胞密度為80%，轉染mimics control、miR-125b mimics。轉染試劑為Lipofectamine2000，轉染步驟按照轉染試劑說明書進行。支氣管上皮細胞分為Control 組、Model 組、miR-NC 組、miR-125b 組，miR-NC 組、miR-125b 組在用300 U/L 塵螨抗原提取物刺激前轉染mimics control、miR-125b mimics。Control 組、Model 組均為沒有轉染的正常支氣管上皮細胞，Model 組細胞用300 U/L 塵螨抗原提取物刺激。各組細胞培養24 h以后，用于后續實驗檢測。

1.2.2 qRT-PCR 分析miR-125b 表達 在Control組、Model 組、miR-NC 組、miR-125b 組細胞中添加1 ml TRIzol試劑，按照常規方法提取細胞RNA，RNA溶解于0.1%的DEPC 水。以微量紫外分光光度計測定OD260/OD280，分析RNA 的濃度和純度，RNA 置于-80 ℃冰箱內保存。分別在EP 管內添加如下試劑進行cDNA 合成：2μl 5×PrimeScript Buffer、0.5μl PrimeScript RT Enzyme mixⅠ、0.5μl RT引物、300 ng總RNA，最后添加RNAse Free dH2O 至10 μl，cDNA合成條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min。PCR 反應體系為：5 μl SYBR Premix Ex Taq、0.2 μl ROX Reference DyeⅡ、1.0 μl cDNA、0.5 μl 正向引物和反向引物，最后添加ddH2O 至10μl。PCR 儀設置反應程序為：預變性（95 ℃30 s，1 個循環），PCR反應（95 ℃5 s，60 ℃34 s，40 個循環）。根據反應的Ct 值，以2-ΔΔCt法計算miR-125b 的表達變化。miR-125b F：5'-TGAAGAACTGTCCTTACGTGACC-3'，miR-125b R：5'-AGAGCACCAAGACTGGCTCT-3'；U6 F：5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3'，U6 R：5'-TGT?CATCATATTTGGCAGGTT-3'。

1.2.3 流式細胞術分析細胞凋亡 在Control、Model、miR-NC、miR-125b組細胞中加入0.25%的胰蛋白酶消化細胞，1 000 g 離心10 min，棄上清液，添加提前預冷的PBS 溶液洗滌細胞2 次。每組收集1×106個細胞，添加結合緩沖溶液400μl，吸取5μl PI和Annexin V-FITC溶液至細胞中，置于室溫、避光環境中結合15 min。流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.4 ELISA 分析IL-6、IL-29 水平 收集Control、Model、miR-NC、miR-125b組細胞培養液上清，ELISA法檢測上清中IL-6、IL-29 含量，步驟完全參照IL-6、IL-29檢測試劑盒。

1.2.5 Western blot 分析Bax、Bcl-2、p65 蛋白表達變化 在Control、Model、miR-NC、miR-125b 組細胞中加入以1∶99比例添加PMSF后的RIPA溶液，用移液器反復吹打混合后，冰上靜置20 min。收集裂解溶液，以14 000 g 離心10 min，將上清溶液吸取、分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。按照BCA 方法檢測蛋白濃度。在蛋白樣品中添加5×SDS-PAGE 緩沖溶液，二者比例為4∶1，100 ℃孵育5 min，冷卻后4 ℃備用。選擇10%的分離膠及4%的濃縮膠進行SDSPAGE 電泳。每個孔中添加30μg蛋白樣品，上層膠采用80 V 電壓電泳20 min，下層膠采用110 V 電壓電泳90 min。根據目的蛋白分子量大小裁剪NC膜，設置300 mA 電流轉膜，轉膜時間為90 min。以TBST 洗滌NC 膜，5 min/次，共洗滌3 次。將NC 膜置于封閉液（5%牛血清白蛋白）中，室溫反應2 h。將NC 膜置于一抗溶液，4 ℃孵育8 h。然后將NC 膜置于二抗溶液，室溫結合2 h。Bax、Bcl-2 一抗按照1∶1 000 稀釋，p65 一抗按照1∶800 稀釋，二抗按照1∶4 000 稀釋。ECL 顯色試劑盒顯色。分析條帶灰度值，以GAPDH 為內參，對目的蛋白表達水平進行半定量分析。

1.2.6 激活NF-κB 信號對miR-125b 調控支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌作用檢測 取轉染miR-125b mimics后的支氣管上皮細胞，用含300 U/L塵螨抗原提取物和1 μmol/L NF-κB 信號激活劑PMA 的細胞培養液刺激24 h，記為miR-125b+PMA組，以miR-125b組為參照，按照1.2.3、1.2.4、1.2.5中流式細胞術、ELISA法、Western blot法分別檢測細胞凋亡和分泌IL-6、IL-29 的水平以及Bax、Bcl-2、p65蛋白表達變化。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0 軟件分析數據，計量資料以±s表示，兩組間數據比較采用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-125b mimics 對過敏原誘導的支氣管上皮細胞中miR-125b表達的影響 Model組支氣管上皮細胞中miR-125b 表達水平低于Control 組（P<0.05）。miR-125b組支氣管上皮細胞中miR-125b表達水平高于miR-NC 組（P<0.05）。見表1。提示miR-125b mimics 提高過敏原誘導的支氣管上皮細胞中miR-125b表達水平。

表1 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中miR-125b水平（±s）Tab.1 Level of miR-125b in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics trans?fection（±s）

表1 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中miR-125b水平（±s）Tab.1 Level of miR-125b in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics trans?fection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC group，2）P<0.05.

miR-125b level 1.00±0.12 0.43±0.061）0.44±0.04 0.95±0.132）96.296<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP

2.2 上調miR-125b對過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡的影響 Model 組支氣管上皮細胞凋亡率升高，Bax 蛋白表達增多，Bcl-2 蛋白表達減少，與Con?trol組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。miR-125b組支氣管上皮細胞凋亡率降低，Bax 蛋白表達減少，Bcl-2蛋白表達增加，與miR-NC組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表2。提示上調miR-125b抑制過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡。

表2 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平（±s）Tab.2 Allergen-induced apoptosis rate and Bax and Bcl-2 protein levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

表2 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平（±s）Tab.2 Allergen-induced apoptosis rate and Bax and Bcl-2 protein levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05.

Bcl-2 0.65±0.05 0.29±0.041）0.30±0.04 0.38±0.032）154.364<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP Apoptosis rate/%7.52±0.65 26.85±2.111）24.96±2.87 14.21±1.332）201.902<0.001 Bax 0.26±0.03 0.85±0.091）0.87±0.07 0.43±0.042）216.677<0.001

圖1 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡Fig.1 Allergen-induced apoptosis of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection

2.3 上調miR-125b 對過敏原誘導的支氣管上皮細胞炎癥因子分泌的影響 Model 組支氣管上皮細胞分泌IL-6、IL-29水平升高，與Control組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。miR-125b 組支氣管上皮細胞分泌IL-6、IL-29 減少，與miR-NC 組相比，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。提示上調miR-125b抑制過敏原誘導的支氣管上皮細胞分泌IL-6、IL-29。2.4 上調miR-125b 對過敏原誘導的支氣管上皮細胞中NF-κB 信號通路的影響 Model 組支氣管上皮細胞中p65蛋白表達水平升高，與Control組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。miR-125b 組支氣管上皮細胞中p65 蛋白表達水平降低，與miR-NC 組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表4。提示上調miR-125b 抑制過敏原誘導的支氣管上皮細胞中NF-κB信號激活。

表4 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白水平（±s）Tab.4 Allergen-induced p65 protein level in bronchial epi?thelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

表4 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白水平（±s）Tab.4 Allergen-induced p65 protein level in bronchial epi?thelial cells after miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miRNC group，2）P<0.05.

p65 0.23±0.03 0.58±0.041）0.56±0.07 0.29±0.022）150.923<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP

圖2 Western blot 檢測miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白表達水平Fig.2 Western blot detection of p65 protein expression in bronchial epithelial cells induced by allergens after miR-125b mimics transfection

表3 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞分泌IL-6、IL-29水平（±s，pg/ml）Tab.3 Allergen-induced IL-6 and IL-29 levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s，pg/ml）

表3 miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞分泌IL-6、IL-29水平（±s，pg/ml）Tab.3 Allergen-induced IL-6 and IL-29 levels of bronchial epithelial cells after miR-125b mimics transfection（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with miR-NC group，2）P<0.05.

IL-29 52.69±4.72 169.85±15.481）167.55±16.27 83.74±6.392）223.777<0.001 Groups Control Model miR-NC miR-125b FP IL-6 99.52±10.23 315.24±25.691）310.86±29.97 189.47±14.202）208.955<0.001

2.5 NF-κB 信號激活劑PMA 促進支氣管上皮細胞中NF-κB 信號激活 miR-125b+PMA 組支氣管上皮細胞中p65 蛋白表達水平升高，與miR-125b 組相比，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表5。提示NF-κB信號激活劑促進支氣管上皮細胞中NF-κB信號激活。

表5 PMA 處理和miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白水平（±s）Tab.5 Levels of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens after PMA treatment and miR-125b mimics transfection（±s）

表5 PMA 處理和miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白水平（±s）Tab.5 Levels of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens after PMA treatment and miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with miR-125b group，1）P<0.05.

p65 0.28±0.04 0.63±0.071）13.024<0.001 Groups miR-125b miR-125b+PMA tP

圖3 Western blot檢測miR-125b mimics和PMA對過敏原誘導的支氣管上皮細胞中p65蛋白表達的影響Fig.3 Western blot detection of effect of miR-125b mimics and PMA on expression of p65 protein in bronchial epithelial cells induced by allergens

2.6 NF-κB信號激活劑PMA 對miR-125b影響過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡和分泌炎癥因子的作用 miR-125b+PMA 組支氣管上皮細胞凋亡率升高，細胞中Bax 蛋白表達增多，Bcl-2 蛋白表達減少，細胞分泌的IL-6、IL-29增多，與miR-125b組相比，差異具有統計學意義（P<0.05），見圖4、表6。提示NF-κB 信號激活劑逆轉miR-125b 影響過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡和分泌炎癥因子的作用。

表6 PMA 處理和miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2 蛋白水平及細胞分泌IL-6、IL-29水平（±s）Tab.6 Allergen-induced bronchial epithelial cell apoptosis，Bax and Bcl-2 protein levels，and cell secretion of IL-6 and IL-29 levels after treatment with PMA and miR-125b mimics transfection（±s）

表6 PMA 處理和miR-125b mimics 轉染后過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡率和Bax、Bcl-2 蛋白水平及細胞分泌IL-6、IL-29水平（±s）Tab.6 Allergen-induced bronchial epithelial cell apoptosis，Bax and Bcl-2 protein levels，and cell secretion of IL-6 and IL-29 levels after treatment with PMA and miR-125b mimics transfection（±s）

Note：Compared with miR-125b group，1）P<0.05.

IL-29/（pg·ml-1）84.17±6.69 142.01±12.741）12.059<0.001 Groups miR-125b miR-125b+PMA tP Apoptosis rate/%13.56±1.20 22.84±1.651）13.646<0.001 Bax 0.45±0.05 0.75±0.071）10.462<0.001 Bcl-2 0.37±0.04 0.26±0.031）6.600<0.001 IL-6/（pg·ml-1）190.25±15.58 276.39±20.851）9.929<0.001

圖4 miR-125b mimics和PMA對過敏原誘導的支氣管上皮細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of miR-125b mimics and PMA on allergeninduced apoptosis of bronchial epithelial cells

3 討論

哮喘有多種誘導因素，如氣候變化、感染、精神因素、過敏原、藥物等，塵螨是最常見的哮喘氣道炎癥誘導因子，也是氣道高反應性發生的重要原因。塵螨刺激后的支氣管上皮細胞脫落，細胞凋亡水平增加，同時產生大量炎癥因子，這些炎癥因子又可進一步刺激支氣管上皮細胞，加速細胞凋亡［11-12］。IL-29是常見的哮喘炎癥因子，其在哮喘患者中表達上調，IL-29具有促進CD4+T細胞分泌IL-6等炎癥因子的作用，放大單核細胞炎癥反應［13］。IL-6 介導Th1/Th2 及Th17/Treg 平衡，是與哮喘氣道炎癥密切相關的促炎因子［14］。細胞凋亡是一個復雜的過程，是細胞內多種基因經過復雜的調控網絡呈現的最終表現，目前發現的與細胞凋亡有關的蛋白家族主要有Bcl-2等，根據在細胞凋亡中的作用，將Bcl-2蛋白家族中的蛋白成員分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，Bax 是Bcl-2 蛋白家族中的促凋亡蛋白，其表達升高后促進細胞凋亡；Bcl-2 是Bcl-2 蛋白家族中的抗凋亡蛋白，其表達升高后抑制細胞凋亡［15-16］。本實驗顯示，塵螨抗原提取物誘導后的支氣管上皮細胞凋亡水平升高，細胞中Bax 蛋白表達增多，Bcl-2蛋白表達減少，細胞分泌的IL-29、IL-6 水平升高，提示塵螨抗原提取物誘導支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌，說明成功構建了體外哮喘支氣管上皮細胞模型。

哮喘的發生受細胞內多種基因的調控，闡明基因在哮喘發生中的作用對于分子靶向治療哮喘具有重要意義［17］。miRNA 是研究較多的非編碼RNA，在人體的不同組織和器官中均有表達，并發揮極為重要的作用，miRNA 在組織中的表達具有時序性、組織特異性，這與miRNA 的功能有關［18］。miR-125b參與腫瘤、心血管系統疾病、關節炎等疾病進程，在人體的不同組織中幾乎均有表達［6，19-20］。既往研究發現，miR-125b 在哮喘患者中表達降低，且可上調miR-125b 抑制塵螨誘導的哮喘小鼠氣道炎癥，改善氣道損傷［7］。本研究發現，塵螨抗原提取物刺激后的支氣管上皮細胞中miR-125b表達水平降低，且可上調miR-125b 表達水平抑制塵螨抗原提取物誘導的支氣管上皮細胞凋亡和IL-29、IL-6 分泌，提示miR-125b 可能具有抑制哮喘支氣管上皮細胞損傷的作用。

NF-κB是在B細胞中發現的一種核因子，NF-κB以二聚體的形式存在于細胞內，p65 是NF-κB 的關鍵亞單位，其表達水平高低與NF-κB 信號激活有關［21］。NF-κB 具有多種作用，如調控細胞生長、凋亡、分化、代謝、炎癥等［22-23］。既往研究發現，NF-κB在哮喘中過度激活，NF-κB激活后誘導炎癥發生，促進細胞凋亡，造成氣道損傷，加重哮喘進程［9，11］。有報道顯示，miR-125b 發揮抗炎作用與下調NF-κB 信號通路有關［8］。本研究發現，塵螨抗原提取物刺激后的支氣管上皮細胞中p65 蛋白表達水平升高，而上調miR-125b 抑制p65 蛋白表達，NF-κB 信號激活劑逆轉miR-125b 對塵螨抗原提取物刺激后的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌，提示miR-125b通過抑制NF-κB 信號參與哮喘支氣管上皮細胞損傷進程。

綜上所述，miR-125b 可能是哮喘治療的分子靶點，上調miR-125b抑制塵螨抗原提取物誘導的支氣管上皮細胞凋亡和炎癥因子分泌，其機制與下調NF-κB 信號通路有關。目前尚不清楚miR-125b 通過何種具體靶向機制影響NF-κB 信號進而參與哮喘進程，課題組在以后實驗中會進行深入研究。