川芎嗪調控NF-κB 信號通路對銀屑病HaCaT 細胞模型趨化因子和炎癥因子表達影響

王 生 劉 洋 張 晶 （河北醫科大學附屬唐山工人醫院皮膚科，唐山 063000）

銀屑病是一種慢性皮膚疾病，病程較長且容易復發，一般藥物治療后的效果并不明顯，遺傳、內分泌、感染、代謝障礙等均可誘導銀屑病的發生［1］。角質形成細胞發育不良、角化過度、炎癥浸潤、毛細血管擴張等均為銀屑病的病理特點［2］。研究顯示，角質形成細胞在銀屑病的發生過程中占據重要地位，其能夠表達炎癥因子IL-6、IL-4、IL-13 和趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC，促進炎癥反應［3］。川芎嗪是一種從中藥川芎分離提取出來的四甲基吡嗪，具有降血壓、利尿、抗血小板凝集、抗腫瘤等功效［4］。既往研究表明，川芎嗪治療后銀屑病小鼠尾部鱗片中顆粒層明顯增加［5］。川芎嗪處理后HaCaT 細胞中EGF10 表達水平降低，而EGF10 是銀屑病發生的促進因子［6］。目前對川芎嗪作用機制的相關研究顯示，川芎嗪抵抗細胞炎癥因子分泌與下調NF-κB 信號通路的激活水平有關［7］。NF-κB 是在人體內發揮多種作用的信號調控通路，在腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病等進展中具有重要調節作用［8］。在銀屑病中發現NF-κB 過度激活，而下調NF-κB 信號水平能夠抑制銀屑病進展，減少銀屑病角質形成細胞炎癥因子分泌［9］。現階段對川芎嗪調控NF-κB 信號影響銀屑病角質形成細胞炎癥因子和趨化因子分泌的作用尚不明確。本實驗以TNF-α 和IFN-γ 刺激人角質形成HaCaT 細胞，體外構建銀屑病HaCaT 細胞模型，探討川芎嗪在銀屑病中的作用及可能機制，為川芎嗪治療銀屑病提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 川芎嗪購自成都德思特生物技術有限公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自美國Abbkine；IL-6含量檢測試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司；IL-4 含量檢測試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司；IL-13含量檢測試劑盒購自上海滬鼎生物科技有限公司；人角質形成HaCaT 細胞購自武漢普諾賽生物科技有限公司；p65抗體、IκBα抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 法檢測川芎嗪對HaCaT 細胞增殖活性的影響 將HaCaT 細胞以3 000個/孔分別接種至96 孔板，將細胞置于飽和濕度、37 ℃、5%CO2培養箱內培養過夜，然后將細胞培養液更換成含有0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/ml 的川芎嗪的細胞培養液培養，24 h 后取出培養板，分別在細胞內添加10μl CCK-8溶液，37 ℃下繼續反應4 h。取出培養板，檢測波長為450 nm 處的A 值，以空白孔調零，計算細胞存活率變化。

1.2.2 實驗分組處理 HaCaT 細胞分為Control、Model、TMP-L、TMP-M、TMP-H組，Model組在實驗0 h時用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養液培養，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組細胞在實驗開始前2 h分別用含有0.1、0.2、0.4 mg/ml的川芎嗪預處理，然后用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養液培養。Control 為空白對照細胞，不做處理。收集Control、Model、TMP-L、TMP-M、TMP-H 組培養24 h 后的細胞用于后續檢測。TNF-α 和IFN-γ刺激后的HaCaT細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平增加，細胞中Eotaxin、RANTES、TARC 表達水平升高，提示成功構建了體外銀屑病HaCaT細胞模型。

1.2.3 qRT-PCR 檢測Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達 收集細胞，在細胞內添加PBS 溶液洗滌2 次，然后吸取1 ml 的Trizol 試劑添加到細胞內，提取細胞總RNA。RNA溶解在80μl的DEPC水中。按以下方法配制逆轉錄體系，包含：2 μl 5×Prime Buffer、0.5μl Radom 6 mers、0.5μl Oligo dT Primer、0.5 μl Prime Script RT Enzyme Mix、500 ng 總RNA，最后添加RNase Free dH2O 至10μl。將上述試劑混合后，瞬時離心，然后在37 ℃下反應15 min，85 ℃反應5 s，4 ℃冷卻。PCR 引物如下：Eotaxin F-5′-AA?CATGGCGGGCTCTGCTAC-3'，R-5′-CCTGCCTTGGGACAGATGCT-3'；RANTES F-5′-CCCCGTGCCGA?GATCAAGGAGTATTT-3'，R-5′-CGTCCAGCCTGGGGAAGGTTTTTGTA-3'；TARC F-5′-ACTGCTCCAGGGATGCCATCGTTTTT-3'，R-5′-ACAAGGGGATGGGATCTCCCTCACTG-3'；GAPDH F-5′-CGTCTAGAAAAACCTGCCAA-3'，R-5′-TGAAGTCAAAGGAGAC?CACC-3'。配制PCR 反應體系，包括：0.5μl 正向及反向引物、5μl SYBR GreenⅠ、1μl cDNA，然后添加DEPC 水至10 μl，首先設置95 ℃孵育40 s，然后以90 ℃孵育3 s，65 ℃退火40 s，共40個循環，以GAPDH為參照，分析Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 水平，計算方法為2-ΔΔCt法。

1.2.4 ELISA 法檢測IL-6、IL-4、IL-13 含量 收集細胞培養液上清，ELISA 分別檢測IL-6、IL-4、IL-13含量，步驟均按照IL-6、IL-4、IL-13 含量檢測試劑盒說明書進行。

1.2.5 Western blot 檢測p65、IκBα 蛋白表達 在RIPA 裂解溶液中以100∶1 比例加入PMSF，混合均勻后置于冰上孵育備用。收集細胞，棄上清，PBS洗滌3 次。將裂解溶液添加到細胞內，渦旋30 s，冰上反應30 min，期間每隔10 min 渦旋1次。4 ℃條件下以12 000 g 離心10 min。吸取上清溶液，添加5×Loading Buffer 混合后，100 ℃煮沸5 min。將玻璃板洗滌干凈并組裝。按照常規方法制備10%的分離膠并灌入玻璃板間，室溫靜置50 min 后，棄去上層的無水乙醇，以濾紙吸干。制備5%的濃縮膠，灌入玻璃板內，室溫結合30 min。以30 μg/孔蛋白樣品進行點樣，設置80 V 電壓電泳30 min，觀察染料進入分離膠后，以120 V 電壓電泳90 min。裁剪PVDF膜，以90 V電壓轉膜。將PVDF膜從電泳槽內取出，并置于TBST 溶液洗滌3 次，然后于5%脫脂奶粉中室溫中孵育1 h。將一抗和二抗分別用封閉液稀釋。將PVDF 膜分別置于一抗、二抗溶液中孵育后，ECL法顯色。內參為GAPDH，分析目的蛋白的表達變化。p65、IκBα以1∶800稀釋，二抗以1∶4 000稀釋。

1.2.6 NF-κB信號激活劑的逆轉作用檢測 HaCaT細胞在實驗開始前2 h 用1μmol/L 的NF-κB 信號激活劑PMA 和0.2 mg/ml 的川芎嗪預處理，然后用含10 ng/ml TNF-α 和10 ng/ml IFN-γ 的細胞培養液培養，記為TMP-M+PMA組，以TMP-M為參照培養24 h后，qRT-PCR檢測Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達（參照1.2.3），ELISA 法檢測IL-6、IL-4、IL-13含量（參照1.2.4），Western blot 檢測p65、IκBα 蛋白表達（參照1.2.5）。

1.3 統計學分析 實驗數據采用SPSS21.0軟件分析，計量資料以±s表示，兩組數據間比較采用t檢驗，多組差異比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川芎嗪對HaCaT 細胞增殖影響 與0 mg/ml川芎嗪處理的細胞相比，0.1、0.2、0.4 mg/ml川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率無明顯變化，而0.8 mg/ml川芎嗪處理的HaCaT 細胞存活率明顯降低（表1）。選擇對細胞增殖活性沒有影響的0.1、0.2、0.4 mg/ml的川芎嗪進行后續實驗。

表1 川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率（±s）Tab.1 HaCaT cell survival rate after ligustrazine treat?ment（±s）

表1 川芎嗪處理后HaCaT細胞存活率（±s）Tab.1 HaCaT cell survival rate after ligustrazine treat?ment（±s）

Note：Compared with 0 mg/ml group，1）P<0.05.

Ligustrazine concentration/（mg·ml-1）Cell survival rate/%100.00±9.65 98.25±10.36 94.22±8.78 92.78±10.54 76.25±6.321）9.350<0.001 0 0.1 0.2 0.4 0.8 FP

2.2 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達影響 結果見表2，與Control 組相比，Model 組HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達水平升高；與Model組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H組HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達水平依次降低。

表2 川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES and TARC mRNA in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表2 川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effect of ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES and TARC mRNA in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

TARC mRNA 1.00±0.11 2.96±0.211）2.03±0.142）1.62±0.122）3）1.14±0.112）3）4）274.267<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP Eotaxin mRNA 1.00±0.09 3.69±0.251）2.75±0.142）2.23±0.162）3）1.40±0.112）3）4）404.835<0.001 RANTES mRNA 1.00±0.10 4.51±0.281）3.27±0.362）2.23±0.172）3）1.80±0.122）3）4）319.748<0.001

2.3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型炎癥因子IL-6、IL-4、IL-13 分泌影響 結果見表3，與Control組相比，Model 組HaCaT 細胞模型分泌的IL-6、IL-4、IL-13 水平升高；與Model 組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組HaCaT 細胞模型分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平依次降低。

表3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effect of ligustrazine on levels of IL-6，IL-4 and IL-13 secreted by HaCaT cell model of psoriasis（±s，pg/ml）

表3 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s，pg/ml）Tab.3 Effect of ligustrazine on levels of IL-6，IL-4 and IL-13 secreted by HaCaT cell model of psoriasis（±s，pg/ml）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

IL-13 5.58±0.42 26.35±2.471）14.20±1.222）10.66±1.042）3）6.42±0.502）3）4）349.781<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP IL-6 96.32±8.87 275.14±26.311）204.15±13.622）162.01±14.812）3）117.62±10.302）3）4）179.493<0.001 IL-4 23.61±1.47 108.62±11.961）80.43±7.792）53.24±4.112）3）31.20±2.262）3）4）245.796<0.001

2.4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中NF-κB 信號通路激活影響 結果見圖1、表4，與Control 組相比，Model 組HaCaT 細胞模型中p65 蛋白水平升高，IκBα 蛋白水平降低；與Model 組相比，TMP-L、TMP-M、TMP-H 組HaCaT 細胞模型中p65 蛋白水平依次降低，IκBα蛋白水平依次升高。

表4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα proteinexpressions in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表4 川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα 蛋白表達的影響（±s）Tab.4 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα proteinexpressions in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with Control group，1）P<0.05；compared with Model group，2）P<0.05；compared with TMP-L group，3）P<0.05；compared with TMP-M group，4）P<0.05.

p65 0.23±0.02 0.86±0.081）0.56±0.052）0.45±0.042）3）0.30±0.032）3）4）235.106<0.001 Groups Control Model TMP-L TMP-M TMP-H FP IκBα 0.96±0.09 0.25±0.041）0.52±0.062）0.63±0.062）3）0.79±0.072）3）4）150.172<0.001

圖1 Western blot檢測川芎嗪對銀屑病HaCaT細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響Fig.1 Effect of ligustrazine on p65 and IκBα protein expressions in HaCaT cell model of psoriasis were detected by Western blot

2.5 NF-κB 信號激活劑對川芎嗪作用的銀屑病HaCaT細胞模型中NF-κB信號激活的影響 結果見圖2、表5，與TMP-M 組相比，TMP-M+PMA 組HaCaT細胞模型中p65蛋白水平升高，IκBα蛋白水平降低。

表5 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effects of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of p65 and IκBα protein in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表5 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中p65、IκBα蛋白表達的影響（±s）Tab.5 Effects of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of p65 and IκBα protein in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with TMP-M group，1）P<0.05.

IκBα 0.60±0.07 0.26±0.031）13.393<0.001 Groups TMP-M TMP-M+PMA tP p65 0.45±0.06 0.98±0.121）11.851<0.001

2.6 NF-κB 信號激活劑對川芎嗪作用的銀屑病HaCaT細胞模型趨化因子表達和炎癥因子分泌的影響 結果見表6，與TMP-M 組相比，TMP-M+PMA 組HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA水平升高，細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13增多。

表6 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達和分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s）Tab.6 Effect of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES，TARC mRNA and secretion of IL-6，IL-4 and IL-13 levels in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

表6 NF-κB 信號激活劑和川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型中Eotaxin、RANTES、TARC mRNA 表達和分泌IL-6、IL-4、IL-13水平的影響（±s）Tab.6 Effect of NF-κB signal activator and ligustrazine on expressions of Eotaxin，RANTES，TARC mRNA and secretion of IL-6，IL-4 and IL-13 levels in HaCaT cell model of psoriasis（±s）

Note：Compared with TMP-M group，1）P<0.05.

IL-13/（pg·ml-1）9.76±0.75 16.42±1.371）12.792<0.001 Groups TMP-M TMP-M+PMA tP Eotaxin mRNA 1.00±0.08 1.86±0.121）17.889<0.001 RANTES mRNA 1.00±0.10 2.64±0.231）19.617<0.001 TARC mRNA 1.00±0.09 1.56±0.131）10.625<0.001 IL-6/（pg·ml-1）163.50±12.84 200.61±13.601）5.952<0.001 IL-4/（pg·ml-1）52.87±5.39 86.48±6.921）11.495<0.001

3 討論

銀屑病是臨床上常見的有遺傳背景的慢性炎癥性皮膚疾病，以紅色丘疹、銀白色鱗屑皮損為主要表現［10］。近年來，角質形成細胞在銀屑病進展中的作用逐漸被揭示，其可分泌大量炎癥因子，促進炎癥反應，加速疾病進展［11］。已經發現有多種細胞因子在銀屑病皮損組織中高表達，并可誘導角質形成細胞分泌更多炎癥因子和細胞因子［12］。TNF-α和IFN-γ 具有誘導角質形成細胞損傷的作用，其也是常見的體外構建銀屑病角質形成細胞模型的誘導因子。既往研究發現，TNF-α 和IFN-γ 刺激后的角質形成細胞分泌的炎癥因子如IL-6、IL-4、IL-13等的表達水平升高，且趨化因子如Eotaxin、RANTES、TARC 的表達水平也升高［13］。IL-6、IL-4、IL-13 等炎癥因子能夠加重炎癥反應，誘導組織損傷。人體組織中有多種趨化因子，其可激活并趨化白細胞，促進組織炎癥發生［14-15］。本研究結果顯示，TNF-α 和IFN-γ 刺激后的HaCaT 細胞分泌的IL-6、IL-4、IL-13水平增加，細胞中Eotaxin、RANTES、TARC表達水平升高，提示體外銀屑病HaCaT細胞模型構建成功。

川芎最初記載于《神農本草經》，歸膽、肝、心包經，味辛、性溫，川芎嗪是從川芎內提取出來的生物堿單體，具有抗炎、抗氧化等功效［16］。有研究顯示，川芎嗪對心肌缺血再灌注、關節炎軟骨細胞等有保護作用，其可降低組織細胞中炎癥因子水平，抑制炎癥反應［7，17］。既往研究發現，川芎嗪對HaCaT 細胞中促銀屑病因子FGF10有抑制功效［6］。川芎嗪腹腔注射后的銀屑病小鼠皮損程度有所緩解［5］。本實驗表明，川芎嗪能夠降低銀屑病HaCaT 細胞模型分泌炎癥因子水平，減少細胞中趨化因子Eotaxin、RANTES、TARC 表達，提示川芎嗪可能通過抑制角質形成細胞分泌促炎因子阻礙銀屑病進程，與既往研究報道相符，說明川芎嗪具有抗銀屑病作用。

NF-κB 最早發現于B 細胞，后續發現NF-κB 參與黏附因子、炎癥因子、生長因子等的表達，其也被認為是免疫及炎癥反應的中心樞紐，NF-κB 激活后不僅能夠誘導下游炎癥因子如IL-6、IL-4、IL-13的表達，還可通過促進趨化因子如Eotaxin、RANTES、TARC 的表達趨化白細胞，促進組織炎癥發生［18］。目前在哺乳動物體內發現了多種NF-κB 信號亞單位，這些成員均有Rel 同源區域，它們通過形成二聚體影響基因的轉錄過程［19］。p65 是經典NF-κB 信號轉導必不可少的亞單位［20］。IκBα 是NF-κB 的抑制蛋白，其可與NF-κB 結合抑制NF-κB 的活性［21-22］。既往研究表明，NF-κB在銀屑病進展中過度活化，其活性升高后促進角質形成細胞促炎因子分泌，而抑制NF-κB 具有保護銀屑病角質形成細胞的作用［23-24］。本研究發現，銀屑病HaCaT 細胞模型中p65蛋白表達水平升高，IκBα 蛋白表達水平降低，而川芎嗪能夠降低p65 蛋白表達水平，促進IκBα 蛋白表達，說明川芎嗪的作用機制可能與NF-κB 有關。既往研究證實，川芎嗪的抗炎作用與NF-κB 有關，其可降低NF-κB 激活水平，抑制LPS 誘導的關節軟骨細胞炎癥損傷，后續在心肌缺血再灌注中也發現川芎嗪的作用機制與NF-κB 有關［7，17］。本研究進一步觀察發現，NF-κB 信號激活劑逆轉川芎嗪對銀屑病HaCaT 細胞模型促炎因子表達作用，川芎嗪參與銀屑病進展與NF-κB 信號有關，與既往研究結果相符，均說明川芎嗪的藥理作用與NF-κB信號有關。

綜上，川芎嗪在銀屑病進展中發揮抑制作用，其可在體外減少銀屑病HaCaT 細胞模型分泌炎癥因子和表達趨化因子，且其機制與NF-κB 信號有關。目前對于川芎嗪通過何種機制調控NF-κB 進而影響銀屑病HaCaT 細胞炎癥尚不明確，課題組在以后的實驗中會進行具體探討。本實驗為川芎嗪治療銀屑病的臨床應用提供了資料，為進一步研究川芎嗪在銀屑病中的作用機制奠定了基礎。