lncRNA XIST通過靶向miR-3666調控胃癌細胞增殖、侵襲轉移機制①

范 淵 吳海龍 竹 夢 周 銳（武漢市第四醫院普外科，武漢 430030）

胃癌是全球高發惡性腫瘤，晚期胃癌主要以全身化療為主，雖能延長腫瘤患者的生存期，但副作用較明顯；近年來，隨著對胃癌進展相關分子機制研究的深入，相應的靶向藥物應運而生，用于臨床治療，但由于基因的不穩定性導致許多靶向藥物療效受限，亟需研究新的靶向藥物［1-2］。研究表明lncRNA 參與了胃癌的進展過程，lncRNA XIST 在胃癌組織及胃癌患者血漿中表達升高，可能是胃癌的一個潛在的腫瘤標志物［3］。lncRNA XIST 高表達與胃癌患者的腫瘤體積，淋巴結浸潤，遠處轉移和TNM 分期顯著相關；而敲低lncRNA XIST 可通過miR-101/Zeste 同源增強子2（enhancer of zeste homo?log 2，EZH2）軸抑制體外細胞增殖、遷移和侵襲以及體內腫瘤生長和轉移［4］。lncRNA XIST 在胃癌MGC803 和BGC823 細胞中高表達，沉默lncRNA XIST 可通過靶向miR-185 抑制胃癌細胞的生長［5］。且lncRNA XIST 高表達與胃癌細胞的耐藥性相關［6］。miR-3666 在胃癌組織中低表達，并且與胃癌的淋巴結轉移相關，提示胃癌患者預后不良［7］。然而miR-3666 對胃癌增殖、遷移和侵襲的影響及lncRNA XIST是否通過調控miR-3666影響胃癌的進展尚不清楚。因此，本實驗旨在研究lncRNA XIST是否通過調控miR-3666 影響胃癌的增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 癌組織和癌旁組織來源 選取武漢市第四醫院2017年6月至2019年12月期間收治的30例胃癌患者，通過手術取其癌組織及癌旁組織，然后立即置于液氮中凍存，后存于-80 ℃冰箱保存備用，所有患者均經病理檢測確診為胃癌，且具有完整臨床病理資料，所有患者均知情且同意，本研究經武漢市第四醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞與主要試劑 正常胃黏膜上皮細胞MRG-1、胃癌細胞SGC-7901、胃腺癌細胞AGS 購自美國ATCC；RPMI1640 培養基購自深圳市豪地華拓生物科技有限公司；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司；熒光定量試劑盒購自上海研卉生物科技有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell 小室、Matrigel購自美國BD 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京冬歌博業生物科技有限公司。XIST 過表達及抑制表達載體質粒、miR-3666 模擬物、miR-3666 抑制劑及陰性對照購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞處理與分組 正常胃黏膜上皮細胞MRG-1、胃癌細胞SGC-7901、胃腺癌細胞AGS 用RPMI1640 完全培養基培養，取對數生長期細胞AGS，將si-NC、si-XIST、pcDNA-NC、pcDNA-XIST、miR-NC、miR-3666 轉染至AGS 細胞，記為si-NC 組、si-XIST 組、pcDNA-NC 組、pcDNA-XIST 組、miR-NC組、miR-3666組；將si-XIST分別與anti-miR-NC、antimiR-3666 共轉染至AGS 細胞，記為si-XIST+antimiR-NC組、si-XIST+anti-miR-3666組。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測lncRNA XIST 和miR-3666 表達水平 各取10 g 癌組織及癌旁組織，剪碎后加液氮研磨，然后加入Trizol 裂解液提取總RNA；各組細胞培養48 h 后離心收集細胞，再加入用Trizol 試劑提取總RNA；然后逆轉錄成cDNA，按照試劑盒說明進行PCR，循環條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s；72 ℃30 s，共40 個循環；相對表達量用2-ΔΔCt法計算。XIST 和miR-3666分別以GAPDH 和U6 為內參，XIST 正向引物序列：5'-AGGGTGTGTGTGCATATGGA-3'，反向引物序列：5'-CCGCCATCTTTTCCTGTACG-3'；GAPDH 正向引物序列：5'-TATGATGATATCAAGAGGGTAGT-3'，反向引物序列：5'-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3'；miR-3666 正向引物序列：5'-ACGAGACGACGA?CAGAC-3'，反向引物序列：5'-CAGTGCAAGTGTAG?ATGCCGA-3'；U6 正向引物序列：5'-AACGAGAC?GACGACAGAC-3'，反向引物序列：5'-GCAAATTC?GTGAAGCGTTCCATA-3'。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖情況 在各組細胞分別培養至0 h、24 h、48 h、72 h 時，每孔加入20 μl 的MTT 溶液，孵育4 h 后加入150 μl DMSO，振蕩反應10 min，用酶標儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移：將細胞用無血清培養基以5×105個/ml 的密度懸浮，取100 μl 懸浮液加入小室上室，600 μl 含10%FBS 的培養液添加到小室下室，溫育48 h，多聚甲醛固定，結晶紫染色，PBS 輕輕清洗2 次；用倒置顯微鏡拍攝染色細胞的照片并計數。細胞侵襲實驗：用Matrigel 包被Transwell 小室的上室，其余與細胞遷移實驗操作相同。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 各組細胞培養48 h，用預冷的PBS 漂洗，按試劑盒說明操作，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測lncRNA XIST 和miR-3666的靶向關系 構建lncRNA XIST野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-XIST 和MUT-XIST，將其分別與miR-NC 和miR-3666共轉染至胃腺癌細胞AGS中；按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析 用SPSS20.0軟件進行統計學分析，計量資料用±s表示，兩組比較行t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA XIST 和miR-3666 在胃癌組織中的表達 用RT-qPCR 檢測lncRNA XIST 和miR-3666 表達水平，結果顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中XIST 表達水平升高，miR-3666 表達水平降低（P<0.05），見圖1。

圖1 lncRNA XIST和miR-3666在胃癌組織中的表達Fig.1 Expression of lncRNA XIST and miR-3666 in gastric cancer tissues

2.2 lncRNA XIST 和miR-3666 在不同細胞株中的表達 培養正常胃黏膜上皮細胞MRG-1、胃癌細胞SGC-7901及胃腺癌細胞AGS，RT-qPCR檢測lncRNA XIST 和miR-3666 表達水平，結果顯示，與MRG-1 細胞相比，AGS、SGC-7901細胞中XIST表達水平升高，miR-3666表達水平降低（P<0.05），見圖2。

圖2 lncRNA XIST和miR-3666在不同細胞株中的表達Fig.2 Expression of lncRNA XIST and miR-3666 in different cell lines

2.3 lncRNA XIST 的敲除對細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將si-NC、si-XIST 轉染至胃癌AGS細胞后，RT-qPCR 檢測結果顯示，si-XIST 組XIST 表達水平低于si-NC組；MTT檢測結果顯示，培養24 h、48 h、72 h后，si-XIST組細胞增殖能力低于si-NC組；Transwell 檢測結果顯示，si-XIST 組細胞遷移和侵襲能力低于si-NC 組，流式細胞術檢測結果顯示，si-XIST 組細胞凋亡率高于si-XIST 組（P<0.05），見圖3。

圖3 lncRNA XIST的敲除對細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.3 Effects of lncRNA XIST knockout on prolifera?tion，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.4 lncRNA XIST 靶向調控miR-3666 的表達TargetScan 在線軟件預測顯示，XIST 的序列中含有與miR-3666互補的核苷酸序列（圖4A）。與miR-NC組相比，miR-3666組轉染WT-XIST 的AGS 細胞的熒光素酶活性降低（P<0.05，圖4B）。抑制lncRNA XIST 表達，miR-3666 表達水平升高；過表達lncRNA XIST，miR-3666表達水平降低（P<0.05，圖4C）。

圖4 lncRNA XIST靶向調控miR-3666的表達Fig.4 lncRNA XIST targets expression of miR-3666

2.5 miR-3666 過表達對胃癌AGS 細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將miR-NC、miR-3666 轉染至胃癌AGS 細胞后，RT-qPCR 檢測結果顯示，miR-3666 組miR-3666 表達水平高于miR-NC 組，MTT 檢測結果顯示，培養24 h、48 h、72 h 后miR-3666 組細胞增殖能力低于miR-NC 組；Transwell 檢測結果顯示，miR-3666 組細胞遷移和侵襲能力低于miR-NC組，流式細胞術檢測結果顯示，miR-3666 組細胞凋亡率高于miR-NC組（P<0.05），見圖5。

圖5 miR-3666 過表達對胃癌AGS 細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.5 Effect of miR-3666 overexpression on prolifera?tion，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

2.6 miR-3666 的抑制逆轉了lncRNA XIST 敲除對胃癌AGS 細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響 將si-XIST分別與anti-miR-NC、anti-miR-3666共轉染至胃癌AGS 細胞后，RT-qPCR 檢測結果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組miR-3666 表達水平低于si-XIST+anti-miR-NC組，MTT檢測結果顯示，培養24 h、48 h、72 h 后si-XIST+anti-miR-3666 組細胞增殖能力高于si-XIST+anti-miR-NC 組；Transwell 檢測結果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組細胞遷移和侵襲能力高于si-XIST+anti-miR-NC組，流式細胞術檢測結果顯示，si-XIST+anti-miR-3666 組細胞凋亡率低于si-XIST+anti-miR-NC組（P<0.05），見圖6。

圖6 miR-3666 的抑制逆轉lncRNA XIST 敲除對胃癌AGS細胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響Fig.6 Inhibition of miR-3666 reversed effect of lncRNA XIST knockout on proliferation，migration，invasion and apoptosis of gastric cancer AGS cells

3 討論

胃癌在全球的發病率及致死率位居前列，針對胃癌的靶向治療是研究熱點，是治療晚期胃癌的新治療手段之一，但胃癌發生發展的分子機制尚未完全明確，有待于進一步探究，以尋找更多新的靶點［8-9］。已有研究報道敲降lncRNA XIST 通過靶向miR-337-3p 下調HOXC8 的表達抑制胃癌AGS 細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化［10］。此外，敲低lncRNA XIST 促進了非小細胞肺癌細胞凋亡并抑制了細胞增殖［11］。沉默XIST 可通過靶向miR-141-3p 抑制胰腺細胞的增殖、遷移和侵襲［12］。本實驗結果顯示，胃癌組織和AGS、SGC-7901 細胞中XIST 表達水平升高，提示XIST可能在胃癌中起促癌基因作用。本實驗進一步敲除lncRNA XIST 后，胃癌細胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力降低，細胞凋亡率升高；表明敲除lncRNA XIST 確實可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡；lncRNA XIST 在胃癌中的作用與在其他癌癥中的作用相同。

研究報道miR-3666 通過靶向SATB2 抑制大腸癌細胞增殖和侵襲［13］。miR-3666 通過靶向KDM2A抑制膠質母細胞瘤細胞的生長和遷移［14］。miR-3666 過表達通過靶向Sirtuin 7 抑制肝癌細胞的生長［15］。本實驗結果顯示，胃癌組織和AGS、SGC-7901 細胞中miR-3666 表達水平降低；過表達miR-3666 后胃癌細胞增殖能力減弱，遷移和侵襲能力降低，細胞凋亡率升高；表明過表達miR-3666 可抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。

研究報道敲低NNT-AS1通過miR-3666/E2F2軸減弱了肺癌細胞的增殖和侵襲，增強了細胞凋亡［16］。說明lncRNA 可通過調控miR-3666 影響腫瘤進展，為了研究lncRNA XIST 與miR-3666 的關系，本實驗首先通過在線軟件預測XIST 的序列中含有與miR-3666 互補的核苷酸序列，說明XIST 可結合miR-3666。本實驗進一步構建XIST 的野生型及突變型熒光素酶報告載體，將其與miR-3666共轉染至AGS 細胞，結果顯示，XIST 野生型熒光素酶報告載體與miR-3666 共轉染后的AGS 細胞的熒光素酶活性降低；且抑制lncRNA XIST 表達可提高miR-3666表達水平，過表達lncRNA XIST 可降低miR-3666 表達水平；表明lncRNA XIST可靶向負調控miR-3666。為研究lncRNA XIST 與miR-3666 相互作用對胃癌的影響，本實驗同時抑制miR-3666 和XIST 的表達，結果顯示胃癌細胞增殖能力增強，遷移和侵襲能力升高，細胞凋亡率降低，說明抑制miR-3666 逆轉了XIST 基因敲除對胃癌AGS細胞增殖、運動性及凋亡的影響。

綜上所述，敲除lncRNA XIST 可通過上調miR-3666 抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。