自噬相關長鏈非編碼RNA在肝細胞癌中的功能分析及預后模型構建①

何 瑩 徐 睿 扈曉宇 （成都中醫藥大學附屬醫院感染科，成都 610072）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種常見的原發性肝癌。約70%～90%的HCC 患者有慢性肝病基礎［1］。HCC的危險因素主要與乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒和黃曲霉毒素暴露有關［2］。在中國，每年報告約46.6萬例新診肝癌患者，并導致42.2 萬例患者病死［3］。在以上肝癌患者中，HBV 攜帶者占80%［4］。肝癌具有臨床癥狀不典型，早期診斷困難，惡性程度高，轉移早，療效差等特點［5-6］。因此深入了解肝癌發生發展的分子機制，探索潛在的預后生物學靶點具有重要意義。

近年來隨著自噬研究的發展，自噬已被認為是多種疾病的潛在治療靶點，特別是惡性腫瘤［7-8］。腫瘤細胞需要自噬來促進生長［9］。近期的一項研究表明，自噬的誘導可以促進膀胱癌的進展［10］。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，參與包括細胞生長，分化和凋亡在內的多種生理活動［11］。越來越多的觀點認為，lncRNAs 的差異表達和突變在腫瘤的惡性增殖中發揮重要作用?；诖耍狙芯繉⒆允蛇@一表型與其可能的調控分子lncRNAs 聯系，運用生物信息學方法，深入挖掘自噬在肝癌中的生物機制，探討自噬相關lncRNAs在肝癌中的預后價值，并構建預測模型，旨在為肝癌患者的個性化診療方案的制定提供研究思路和參考依據。

1 資料與方法

1.1 數據下載與處理 本研究通過TCGA 數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/），獲取374 例肝癌腫瘤組織樣本和50 例瘤旁樣本的高通量測序數據。同時下載377 例臨床數據樣本，其中1 例缺少生存數據，予以剔除。所有測序數據將標準化為每百萬reads 中來自于某基因每千堿基長度的reads 數，以消除測序深度對后續分析的影響［12］。從Ensembl 數據庫（http：//www.ensembl.org/index.html）下載人類參考基因組GRCh38.84 對測序數據進行注釋，并分離其中的mRNA 和lncRNAs。所有臨床數據在剔除正常組織樣本后，最終獲得370例包含生存時間、生存狀態和轉錄信息的樣本，將被用于生存分析。其中235 例包含完整年齡、性別、腫瘤分級、分期等信息的樣本將被用于獨立預后分析。

1.2 自噬相關lncRNAs 的獲取 自噬基因列表從人類自噬數據庫（human autophagy database，HADb）（http：//www.autophagy.lu/）下載。將該基因列表映射到HCC 轉錄數據中以獲取自噬相關mRNAs。皮爾遜相關分析用于確定自噬相關mRNAs 共表達lncRNAs。本研究以相關系數R2>0.4 且P<0.05 作為篩選標準對結果進行過濾。

1.3 預后風險評分模型構建 R 包“survplot”用于KM 生存分析和單變量Cox回歸分析，兩種分析方法中均滿足P<0.05的lncRNAs 被認為具有預后價值，將進行下一步分析?！癵lmnet”包將用于Lasso 回歸和Cox 分析以構建風險評分模型［13-14］?；颊唢L險評分由以下公式確定：風險評分=β1×Exp LncRNA1+β2×Exp LncRNA2+…+βn×Exp LncRNAn。Exp Lnc-RNA代表LncRNA 表達值，β為多元Cox回歸分析的相應系數，風險評分>中位數的病例定義為高風險組，反之則為低風險組。KM 生存曲線比較重分組后高低風險兩組的生存差異。一年、三年、五年期受試者工作特征曲線（ROC）檢驗預后模型的敏感度和特異度。

1.4 基因集功能定義 Metascape 數據庫（metascape. org/gp）被用于京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）和基因本體論（gene ontology，GO）富集分析，以探討具有預后價值的自噬相關lncRNAs 的生物學功能。由于目前lncRNAs 的功能研究尚不充分，本研究將通過lncRNAs 共表達的mRNAs 進行功能分析。Cytoscape 軟件用于共表達關系的可視化展示。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）將被用于重分組后HCC 患者的基因集富集分析，隨機組合的數量被設置為10次。

1.5 統計學處理 本研究將年齡、性別、腫瘤分期、分級和風險分組等處理為二分類變量，通過多因素Cox回歸以尋找可能的獨立預后因子。計算風險比（HR）及95%可信區間（95%CI），以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 有預后價值的自噬相關lncRNAs 鑒定 通過TCGA 數據庫和HADb 數據庫收集HCC 自噬相關mRNAs 共203 個。運用相關性檢驗，經R2>0.4 且P<0.05 過濾篩選，最終獲得545 個與自噬相關mRNAs 共表達的lncRNAs。這545 個自噬相關lnc-RNAs進一步通過單因素Cox 和KM 分析，最終獲得46個與肝癌預后相關的lncRNAs，進行Lasso和多因素Cox分析后（圖1A），最終篩選出10個與自噬相關的lncRNAs進行預后模型構建（圖1B）。

圖1 自噬相關lncRNAs預后價值評估Fig.1 Evaluation of prognostic value of autophagy-related lncRNAs

2.2 自噬相關lncRNAs 功能鑒定 通過KM 和單因素Cox 分析篩選了46 個在HCC 中具有預后價值的自噬相關lncRNAs。這46個lncRNAs通過皮爾遜相關性分析，構建了115個lncRNA-mRNA 共表達關系對，其中包括51 個mRNAs（圖2A）。KEGG 通路和GO 生物學功能主要富集在宏自噬（GO：0016236），細胞應激反應調節（GO：0080135），自噬-其他（hsa04136），凋亡信號通路（GO：0097190），肽酶活性的調節（GO：0052547）等（圖2B、C）。

圖2 KEGG和GO功能富集分析Fig.2 KEGG and GO function enrichment analysis

2.3 肝細胞癌患者預后標志 將多因素Cox 分析后的各項參數代入公式：風險評分=0.003 7×HMGN3-AS1 表達量-0.013 9×C1orf132 表達量+0.047 2×MIR137HG 表達量-0.010 9×LINC00426 表達量+0.000 3×C10orf91 表達量+0.000 2×ZFPM2-AS1 表達量+0.003 8×MKLN1-AS 表達量-0.000 5×F11-AS1 表達量+0.000 8×LINC01508 表達量+0.006 0×MCM3AP-AS1 表達量。計算出每位患者風險得分，以中位數作為截止值對患者再分組，其中風險得分高于中位數的患者被定義為高風險組，而反之則為低風險組（圖3A）。熱圖用于觀察高危和低危組自噬相關lncRNAs 的表達差異（圖3B）。通過該模型對患者生存狀態進行預測，高危險評分組死亡率明顯高于低危險評分組（圖3C）。生存分析結果表明在肝癌患者中，高風險組患者生存時間顯著低于低風險組（P<0.001，圖3D）。

圖3 自噬相關lncRNAs構建預后模型的預后特征Fig.3 Prognostic characteristics of autophagy related lnc-RNAs constructed prognostic model

2.4 患者風險評分是肝細胞癌的獨立預后因素

研究根據自噬相關lncRNAs構建的風險模型是否獨立于其他臨床參數。對患者的年齡、性別、分期、分級、轉移等臨床信息進行了Cox回歸分析（表1）。結果表明該風險模型是肝癌獨立預后因素（HR=3.666，P<0.001，表1、圖4A、B）。通過ROC 曲線下面積評價各臨床參數預測預后的敏感度和特異度（圖4C），該模型預測HCC患者一年生存率的曲線下面積為0.809，明顯優于其他臨床變量，預測三年和五年生存率的曲線下面積分別是0.751、0.736（圖4D）。以上結果表明該風險預測模型具有良好的敏感度和特異度。

圖4 自噬相關lncRNAs構建的風險評分模型在肝癌預后中的獨立性Fig.4 Independence of risk score model constructed by autophagy related lncRNAs in prognosis of liver cancer

表1 患者的臨床特征Tab. 1 Clinical characteristic of patients

2.5 GSEA 富集分析 本研究運用風險評分模型將370 例肝癌患者分為兩組進行GSEA 富集分析（185 例高風險vs85 例低風險）。結果只展示滿足校正后富集得分絕對值>1，名義P值<0.001，錯誤發現率<0.25 的前7 項富集結果（表2）。結果表明KEGG_RNA 降解、KEGG_剪接體、KEGG_嘌呤代謝、KEGG_嘧啶代謝、KEGG_細胞周期、KEGG_黏合連接、KEGG_卵母細胞減數分裂這7 個基因集與肝癌高風險狀態具有顯著相關性，以上基因集在高風險組肝癌患者中高表達。而KEGG_補體及凝血級聯和KEGG_精氨酸和脯氨酸代謝則高表達于低風險組肝癌患者（圖5）。

圖5 風險分組后GSEA富集分析Fig.5 GSEA enrichment analysis after risk grouping

表2 GSEA富集分析結果Tab.2 GSEA enrichment analysis results

3 討論

HCC 是第六種最常見的腫瘤，也是第三種最常見的癌癥死亡原因［15］。盡管隨著醫療技術的發展，針對中期HCC 的經動脈化療栓塞和針對晚期腫瘤的全身藥物治療手段已越發成熟，但在HCC 患者在長期生存方面仍不令人滿意。因此，迫切需要尋找與患者預后密切相關的新的治療靶點。自噬是調節細胞死亡和存活的關鍵途徑［16］。而目前普遍的觀點認為lncRNAs 在調節炎癥、細胞凋亡和自噬方面具有關鍵作用［17］。因此有理由相信在HCC 中，自噬這一生物學過程發揮了決定腫瘤細胞存亡的關鍵作用，而這一過程可以被lncRNAs 調控。目前尚無在肝癌領域的相關報道。基于此，本研究通過生物信息學的方法，首次對自噬相關lncRNAs 在肝細胞癌中的分子機制和預后價值進行探討，最終構建了由10 個自噬相關lncRNAs 組成的風險評分模型，該模型無論是特異度亦或是敏感度上均有良好表現，這10 個lncRNAs 可能通過干預細胞自噬從而影響HCC患者的預后。

本研究發現，在HCC 中具有預后價值的自噬相關lncRNAs 的功能主要集中于自噬、細胞應激反應調節、凋亡信號通路、肽酶活性的調節等。這些生物學功能均與自噬相輔相成，應激是自噬的激活條件，但當應激水平超過一定閾值時，細胞凋亡就會被激活［18］。自噬可以促進、抑制和伴隨凋亡［19］。肽酶參與了每一個生物過程，自噬本就是一個需要激活多種肽酶的生物過程。提示本文篩選的lncRNAs可從多方向調控自噬。自噬在腫瘤中的雙重作用主要體現在不同的時間節點。對尚未成瘤的正常細胞，自噬通過去除受損的細胞器并減少氧化應激來減輕DNA 損傷和基因組不穩定性，從而抑制腫瘤發生。但已成瘤細胞，腫瘤微環境中的炎癥會誘發自噬，誘導型自噬可清除有毒的氧自由基或受損的錯誤折疊蛋白，減輕內質網應激，維持線粒體功能，維持新陳代謝，產生再循環的養分，而這些均構成了癌細胞重要的生存機制［20-21］。自噬基因Beclin1缺陷會導致細胞自噬的下調，Beclin1 基因缺陷小鼠在包括肝臟在內的多個組織中自發發生的腫瘤，且在HBV 感染后極易感染發展為HCC［22-24］。另一方面，Beclin1 的缺失又會導致腫瘤細胞在諸如缺氧等壓力條件下更易死亡［25-26］。自噬除維持腫瘤的生存外，尚與腫瘤轉移，上皮細胞-間充質細胞轉化，和耐藥性密切相關［27-30］。

盡管lncRNAs 的研究日漸深入，但具體所涉及的功能方向及分子機制尚存爭議。研究表明lncRNAs 可以調節癌細胞的增殖、存活、遷移/轉移以參與腫瘤的發生發展，如lncRNA P5848的上調可以導致HCC癌細胞增殖和遷移［31-33］。這些功能與自噬在腫瘤中的作用部分重疊，因此本課題組認為lncRNAs 可能很大程度通過影響瘤細胞的自噬發揮相應作用。事實上盡管相關研究較少，但已有報道證實lncRNA HULC 在肝癌中高度上調，并損害化療敏感性［34］。本研究最終篩選出10 個具有預后價值的自噬相關lncRNAs（MIR137H、C1orf132、C10orf91、LINC00426、F11-AS1、ZFPM2-AS1、LIN-C01508、HMGN3-AS1、MKLN1-AS、MCM3AP-AS1）建立預后模型。并對患者的死亡風險進行評估，最終結果顯示：高風險組的臨床結局要明顯差于低風險組。MIR137HG 是MIR137的宿主基因，其啟動子在大腸癌、惡性胸膜間皮瘤和口腔鱗狀細胞癌中高度甲基化，提示該lncRNA 與多種腫瘤密切相關［35-37］。同時也有研究報道稱MIR137HG基因變異與中國黎族人群肝癌風險相關［38］。C1orf132的下調的可能釋放靶向RBL2 和CCND3 的miRNAs，從而促進腫瘤進展［39］。C10orf91與口腔鱗狀細胞癌患者的總生存時間有關［40］。Linc00426 下調可抑制體內肺癌細胞的腫瘤發生和轉移，然而該lncRNA 在不同腫瘤中的表達情況具有顯著差異，Linc00426在乳腺癌中被上調，在結直腸癌、非小細胞肺癌中則被下調［41-43］。F11-AS1通過與microRNA-211-5p結合來調節NR1I3，從而抑制了HBV 相關的肝癌進展［44］。ZFPM2-AS1是新發現的與腫瘤進展有關的lncRNA，一項研究證實ZFPM2-AS1 在肝細胞癌組織和細胞系中升高，且ZFPM2-AS1 的高表達與靜脈浸潤、TNM 分期、較短的總生存期有關［45］。LINC01508的表達水平與不良預后顯著相關，該lncRNA 在乳腺癌中顯著上調［46］。MCM3AP-AS1 可抑制結直腸癌的進展，促進前列腺癌細胞增殖和侵襲［47-48］。核小體結合蛋白HMGN3屬于染色質結構蛋白家族，可促進組蛋白乙?；娃D錄因子的招募來增強其靶基因的轉錄［49］。MKLN1-AS 也被報道為肝癌的危險因素，這與本研究結果相一致［50］。以上lncRNAs大部分參與了腫瘤的發生發展，但尚無其與自噬的相關研究，這也意味著該研究方向具有較大發展潛力。最后，根據GSEA 富集分析結果。本課題組推測，高風險組患者中ZFPM2-AS1、C10orf91、LINC01508、HMGN3-AS1、MKLN1-AS、MCM3AP-AS1、MIR137HG 這些自噬相關lncRNAs 可能通過抑制RNA 降解、促進嘌呤代謝、嘧啶代謝、加快細胞周期、促進上皮細胞間充質轉化從而促進腫瘤發展。而C1orf132、LINC00426、F11-AS1的作用則可能正好相反。

綜上所述，本研究報道了在HCC 中具有顯著預后價值的自噬相關lncRNAs，并對其功能進行了初步探討，構建了一個具有良好敏感度和特異度的預后模型。提示本次篩選的lncRNAs可作為自噬介入HCC 研究的新切入點，并且可以作為潛在的HCC 治療新靶點。但仍需未來更進一步的研究予以驗證。