鉬礦開采對球囊霉素相關土壤蛋白和土壤化學計量特性的影響①

張夢歌，尹可敬，石兆勇,2,3*，焦 陽

鉬礦開采對球囊霉素相關土壤蛋白和土壤化學計量特性的影響①

張夢歌1，尹可敬1，石兆勇1,2,3*，焦 陽1

(1 河南科技大學農學院，河南洛陽 471023；2 洛陽市共生微生物與綠色發展重點實驗室，河南洛陽 471023；3 河南省鄉村人居環境工程中心，河南洛陽 471023)

以不同開采程度鉬礦區根際土壤為研究對象，探索了鉬礦開采對土壤球囊霉素相關土壤蛋白、化學計量特性及其兩者之間關系的影響。結果表明，開采區土壤碳、氮含量分別為25.30和1.00 g/kg，顯著低于恢復區和未開采區土壤的碳、氮含量。開采區土壤的碳氮比達到29.36，分別是恢復區和未開采區的2.02倍和1.30倍。恢復區和未開采區土壤的總提取球囊霉素含量為2.81和3.64 mg/g，易提取球囊霉素含量為1.22和2.02 mg/g，分別是開采區土壤總提取和易提取球囊霉素的2.08倍、2.70倍和1.97倍、3.26倍。此外，土壤碳、氮含量對叢枝菌根真菌分泌球囊霉素相關土壤蛋白有顯著的影響。可見，鉬礦開采主要導致了土壤碳、氮的大量流失，并對叢枝菌根真菌分泌球囊霉素相關土壤蛋白具有明顯的抑制作用。

鉬礦區土壤；不同開采程度；土壤化學計量特征；球囊霉素相關土壤蛋白

鉬礦是我國的優勢礦種之一，主要分布于河南、陜西、遼寧等省區[1]，其中河南省洛陽市欒川縣鉬儲量達206萬t，位居亞洲第一，日采礦量可達1.3萬t[2]。豐富的礦產資源雖然為當地創造了巨大的經濟效益，但此前研究也已證明[3]，礦山采掘、剝離、開采以及尾礦廢渣堆積等人為活動不僅會對地表植被造成直接破壞，還會破壞土壤結構，造成土壤養分的大量流失，這也是導致礦區植被短期內難以恢復的一大重要原因，因此對礦區土壤養分特征的研究也就尤為必要。

有研究表明，土壤碳、氮、磷的特性是衡量其有效性的重要指標，對揭示土壤養分含量以及碳、氮、磷元素的循環和平衡機制具有重要的意義。而土壤生態化學計量學結合了化學、生物學與生態學等學科的基本原理，以土壤碳、氮、磷含量變化為主要指標[4]，對研究生態系統養分循環及養分間的限制與平衡具有重要指示意義，并已引起許多學者的廣泛關注[5-7]。學者們對于鉬礦區的研究，主要關注重金屬的形態及穩定性等方面[8-9]，而關于鉬礦開采對土壤生態化學計量特征影響的研究較少。此外，關于鉬礦區土壤叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)分泌物—球囊霉素相關土壤蛋白(glomalin-related soil protein, GRSP)與生態化學計量特性的關系也知之甚微。

作為AMF的代謝產物，GRSP廣泛分布于陸地生態系統中[10]。Purin和Rillig[11]根據GRSP提取的難易程度將其分為總提取球囊霉素(total extractable glomalin，TG)和易提取球囊霉素(easily extractable glomalin，EEG)。已有研究表明GRSP難溶于水，在土壤中的性質極為穩定，是土壤碳庫和氮庫的重要來源，同時GRSP還具有改善土壤結構、增強土壤團聚體的穩定性等作用[12-13]。不同生態系統中GRSP對土壤生態化學計量特征的響應是近年來的研究熱點之一。張夢歌等[14]在熱帶雨林的研究發現，TG和EEG含量均隨著土壤全碳、全氮和碳氮比的增大顯著增加，而與土壤全磷含量沒有明顯的相關關系。馬潔怡等[15]對鹽堿地土壤的研究發現，TG與土壤全磷含量沒有相關關系，而EEG則與土壤全磷含量呈顯著的負相關關系。張亞娟等[16]在沙地的研究發現，TG和EEG含量均與土壤全氮、全磷呈顯著的正相關關系。而鉬礦開采對AMF分泌GRSP的影響并不清楚，不同開采程度的土壤化學計量特性對GRSP的影響也鮮有報道。

因此本研究以不同開采程度鉬礦區植物根際土壤為研究對象，測定其碳、氮、磷和GRSP含量，分析土壤GRSP和生態化學計量特征變化規律及其兩者之間的關系，從而為日后鉬礦區的生態修復提供更多的理論基礎和科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況與樣品的采集和處理

本研究選擇河南洛陽鉬礦區的3個典型區域進行研究，分別為開采區、恢復區和未開采區。其中開采區設置在正在開采的中心礦區的邊緣，且有較好的植被覆蓋，距離礦區中心約600 m；恢復區為2012年停止鉬礦開采，正處于自然恢復階段的區域；未開采區位于已探明鉬儲量但還未進行鉬礦開采的區域。

每個研究區域內設置5個采樣點，每個采樣點內設置5個20 m × 20 m的樣方，對各樣方內優勢植物的植物種進行記錄(表1)；同時采集每個樣方內同種優勢植物及其根系周圍0 ～ 20 cm土壤3 ～ 5份，并混合成一份土壤樣品，即每個樣方采集5個土壤樣品，每個區域采集25個土壤樣品，共75個土壤樣品。將采集的土壤樣品帶回實驗室，風干處理，進行相關指標的測定。

表1 不同開采程度鉬礦區的植物種

1.2 土壤理化性質的測定

土壤全碳、全氮含量用元素分析儀測定[17]，土壤全磷含量采用高氯酸–濃硫酸消煮–鉬銻抗比色法測定[18]。

1.3 球囊霉素相關土壤蛋白的測定

TG和EEG的含量根據Wright 等[10]和David 等[19]的方法測定。EEG的主要提取步驟：取1 g風干土于試管中，加入8 ml檸檬酸鈉浸提劑(20 mmol/L pH 7.0) ，在103 kPa、121 ℃ 條件下提取90 min后，在6 000 r/min下離心15 min，收集上清液。TG提取方法：在裝入1 g風干土的試管中，加入8 ml檸檬酸鈉浸提劑(50 mmol/L，pH 8.0) ，于103 kPa、121 ℃ 條件下連續提取60 min，并重復提取2次；6 000 r/min下離心15 min，收集上清液。分別吸取上清液0.5 ml加入5 ml考馬斯亮藍G-250染色劑，在595 nm波長下比色；用牛血清蛋白作為標準液，考馬斯亮藍法顯色，繪制標準曲線，計算出球囊霉素相關土壤蛋白的含量。

1.4 數據處理

使用SPSS 21.0對不同開采程度鉬礦區全部植物根際土壤及不同開采程度鉬礦區草本和木本植物根際土壤的碳、氮、磷和GRSP含量分別進行單因素方差分析，對鉬礦區植物根際土壤的碳、氮、磷間的關系進行Pearson相關分析。土壤碳、氮、磷對GRSP含量的影響，則采用線性回歸的方法進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同開采程度鉬礦區土壤碳、氮、磷的分布特征

通過對3個區域根際土壤碳、氮、磷含量的測定發現(圖1)，未開采區土壤的全氮、全碳含量均顯著高于開采區域(<0.05)，未開采區土壤的全氮含量分別為開采區和恢復區全氮含量的2.70倍和1.35倍，全碳含量則分別為開采區和恢復區的2.01倍和1.74倍。木本植物根際土壤的全磷含量在3個區域間均沒有顯著差異。未開采區木本植物的全氮、全碳含量分別為2.76 g/kg 和48.13 g/kg，而未開采區草本植物根際土壤的全氮、全碳含量則分別2.70 g/kg和53.50 g/kg。

(圖柱上方不同小寫字母表示鉬礦區不同開采程度下同種植物類型根際差異達P<0.05顯著水平，下同)

此外，3個區域植物根際土壤的碳氮比范圍為13.53 ～ 29.74(圖2)，恢復區根際土壤的C/N顯著低于其他兩個區域。通過對不同生活型植物根際土壤的碳氮比調查也得到相似的結果，其中恢復區木本植物根際土壤的碳氮比為13.53，草本植物根際土壤的碳氮比為15.66。

2.2 不同開采程度鉬礦區土壤碳、氮、磷間的關系

總體來看，鉬礦區土壤碳含量與氮含量間存在極顯著的正相關關系(=0.707，<0.01)，與之相似，氮磷間也存在極顯著的正相關關系(=0.374，<0.01)，而碳含量與磷含量沒有明顯的相關關系(=0.057，>0.05)。進一步分析不同開采程度鉬礦區土壤碳、氮、磷間的相關關系發現，恢復區和未開采區土壤碳氮間均存在極顯著的正相關關系(=0.905，<0.01；=0.614，<0.01)，而開采區土壤碳、氮、磷間均不存在顯著相關關系(表2)。

圖2 不同開采程度鉬礦區植物根際土壤的碳氮比

2.3 不同開采程度鉬礦區土壤球囊霉素相關土壤蛋白的分布特征

總體來看，洛陽鉬礦區土壤TG的含量變化范圍為1.35 ～ 4.06 mg/g，EEG含量的變化范圍為0.57 ～ 2.22 mg/g，其中未開采區植物根際土壤TG和EEG含量都顯著高于開采區和恢復區土壤的TG和EEG含量(<0.05)(圖3A)。進一步比較不同開采程度鉬礦區草本或木本植物根際土壤的TG和EEG含量發現，未開采區木本植物根際土壤TG和EEG含量分別為4.07和1.81 mg/g，均顯著高于恢復區和開采區TG和EEG含量；無論是TG還是EEG含量，都是在開采區其含量最低，分別為1.34 和0.57 mg/g(圖3B)。與木本植物相似，草本植物根際土壤的TG和EEG含量也是在未開采區達到最大，分別為3.30 和2.22 mg/g，且顯著高于恢復區和開采區(圖3C)。

表2 不同開采程度鉬礦區土壤碳、氮、磷的相關性

注：左下同一對指標的兩個數字分別代表3個區域總的相關系數和開采區的相關系數；右上同一對指標的兩個數字分別代表恢復區和未開采區的相關系數。*、** 分別表示相關性達<0.05和<0.01顯著水平。

圖3 不同開采程度鉬礦區植物根際土壤球囊霉素相關土壤蛋白的含量

2.4 不同開采程度鉬礦區土壤碳、氮、磷含量對球囊霉素相關土壤蛋白的影響

通過對不同開采程度鉬礦區植物根際土壤碳、氮、磷含量對GRSP影響的分析可知，土壤碳、氮、磷含量對TG和EEG均有顯著的影響(圖4A、5A和6A)。進一步分析不同開采程度土壤碳、氮、磷含量對GRSP的影響發現，開采區土壤的碳、磷含量對TG和EEG均沒有顯著的影響(圖4B和圖6B)，而氮含量對TG和EEG有極顯著的影響(圖5B)?；謴蛥^土壤的碳、氮含量對TG和EEG有極顯著的影響(圖4C和圖5C)，而恢復區土壤磷含量對TG和EEG沒有影響(圖6C)。未開采區土壤TG僅受氮的顯著影響，不受碳、磷含量的影響；EEG則與碳、氮、磷均沒有顯著的關系(圖4D、5D和6D)。

3 討論

已有研究表明土壤碳、氮、磷是許多生態系統生產力和物質循環的主要限制因素[4-5]，其可以直接反映土壤肥力的基本狀況。在本研究中，未開采區土壤碳的平均含量為51 g/kg。未開采區土壤氮、磷的平均含量為3 g/kg和1 g/kg，與全國第二次土壤普查養分分級標準相比[20]，分別高于一級和二級標準，處于豐富和較豐富水平，但其低于陜西煤礦區土壤氮、磷含量[21]，可能是由于鉬礦露天開采移走大量的表層土壤，而本研究中開采區采集的根際土壤樣品是在受到鉬礦開采干擾后所留下的根際土壤，難以避免是深層次土壤受鉬礦開采而翻堆至表層的土壤，從而導致其碳、氮含量顯著低。本研究發現開采區土壤碳、氮含量均顯著低于未開采區土壤的碳、氮含量，而土壤磷含量在兩個區域間沒有顯著差異，說明鉬礦開采主要造成了開采區土壤碳、氮這兩種養分的大量流失?；謴蛥^木本植物根際土壤的碳含量為34.39 g/kg，顯著高于開采區木本植物根際土壤的碳含量，說明恢復區隨著自然植被的恢復，有效減少了養分大量流失，土壤碳含量逐步提高，這一結果與之前研究結果相一致[22]。同時還發現恢復區草本植物根際土壤的碳、氮含量均顯著低于未開采區草本植物，說明土壤養分恢復是一個緩慢的過程。

(*、**、***分別表示相關性達P<0.05、P<0.01和P<0.001顯著水平，下同)

圖5 不同開采程度鉬礦區土壤氮含量對球囊霉素相關土壤蛋白的影響

圖6 不同開采程度鉬礦區土壤磷含量對球囊霉素相關土壤蛋白的影響

土壤碳氮比和有機質的分解與積累密切相關，是反映土壤養分循環的重要指標，通過對礦區土壤碳氮比的研究，有助于明確礦區土壤養分和能量循環對環境變化的響應。本研究發現，開采區土壤碳氮比約為恢復區土壤碳氮比的2.02倍，表明鉬礦開采顯著提高了土壤的碳氮比。通常情況下，碳氮比高表明有機質具有較慢的礦化作用，而植物、土壤微生物主要是以無機氮素為營養的，所以土壤有效氮可能成為限制開采區植物正常生長發育的限制因素?？梢娫陂_采區植被恢復的治理初期要加大無機氮的投入，從而創造更有利植物生長的環境條件，使土壤碳氮比能處于較平衡的狀態。同時還發現，恢復區土壤碳氮比為14.56，與全球、中國土壤碳氮比均值(分別為14.3和14.4)均十分接近[23]，說明恢復區經過長期的自然恢復，土壤碳氮比逐漸趨向平衡的狀態。研究業已表明，因為土壤氮素大多是以有機態的形式存在于土壤有機碳中，而土壤有機碳又是土壤全碳的一部分，所以土壤碳氮間存在著一定的耦合關系[23]。

此前研究發現[24-25]耕作施肥、石油開采、重金屬脅迫等因素對土壤GRSP含量有顯著影響。在本研究中發現，鉬礦開采顯著降低了土壤GRSP的含量，恢復區和未開采區TG含量分別是開采區的2.28倍和2.70倍，EEG則分別是開采區的1.97倍和3.26倍。而鉬礦開采導致土壤GRSP含量顯著降低主要是因為AMF是以碳素為能源、氮素為營養的[16]。鉬礦開采造成土壤養分大量流失，同時開采區土壤的高碳氮比表明氮的礦化速率較低。這兩個因素造成AMF無法獲取足夠其維持正常生理活動的營養物質，并最終導致其分泌GRSP含量的顯著減少。

業已證明，GRSP與土壤碳、氮存在一定的相關性[12-15, 26]。本研究通過對GRSP和土壤碳、氮的關系調查發現，GRSP與土壤碳、氮呈極顯著正相關關系，進一步證實了GRSP是土壤碳庫和氮庫的重要來源?；謴蛥^土壤碳、氮含量對TG和EEG均存有顯著的影響，而未開采區土壤只有氮含量對TG有極顯著的影響，由于植物種類是導致GRSP含量變化的一個關鍵因素，因此出現這一結果的原因可能與植物種類有關。馬潔怡等[15]也研究發現同一區域不同樹種根際土壤GRSP含量存在顯著差異。胡家欣等[27]則發現不同樹齡的同一樹種根際土壤的GRSP含量也可能存在顯著差異。而未開采區草本植物和木本植物的種類不一，所以土壤碳對GRSP是否有顯著的影響有待進一步研究。GRSP含量這一結果在本研究中也得到證實，雖然總體上土壤磷含量對GRSP有顯著的影響，但不同開采程度鉬礦區土壤磷含量對GRSP沒有顯著的影響，原因可能是土壤中的磷主要來源于巖石的風化，在土壤中的含量相對穩定[28]，而GRSP易受植被類型、土壤碳氮含量等因素影響[29]，導致同一開采程度區域內GRSP含量變化較大，所以二者在不同開采程度鉬礦區的關系均較弱。

4 結論

鉬礦開采主要導致了土壤碳、氮的大量流失，并顯著提高了土壤的碳氮比。此外，鉬礦開采顯著降低了土壤的TG和EEG含量，對叢枝菌根真菌分泌GRSP具有明顯的抑制作用。

[1] 張照志, 王賢偉, 張劍鋒, 等. 中國鉬礦資源供需預測[J]. 地球學報, 2017, 38(1): 69–76.

[2] Zeng Q D, Liu J M, Qin K Z, et al. Types, characteristics, and time-space distribution of molybdenum deposits in China[J]. International Geology Review, 2013, 55: 1311–1358.

[3] 黃仲德. 礦山開采對生態環境的影響及礦區生態修復分析[J]. 中國資源綜合利用, 2020, 38(10): 134–136.

[4] 賀金生, 韓興國. 生態化學計量學: 探索從個體到生態系統的統一化理論[J]. 植物生態學報, 2010, 34(1): 2–6.

[5] 區曉琳, 陳志彪, 陳志強, 等. 亞熱帶侵蝕紅壤區植被恢復過程中土壤團聚體化學計量特征[J]. 土壤學報, 2018, 55(5): 1156–1167.

[6] 寧志英, 李玉霖, 楊紅玲, 等. 沙化草地土壤碳氮磷化學計量特征及其對植被生產力和多樣性的影響[J]. 生態學報, 2019, 39(10): 3537–3546.

[7] 趙洛琪, 付登高, 吳曉妮, 等. 滇中不同植物群落土壤養分及其計量比的變化特征[J]. 土壤, 2020, 52(6): 1248–1255.

[8] 程俊偉, 蔡深文, 黃明琴. 貴州毛石鉬礦區土壤及表層沉積物中重金屬形態分析及生態風險評價[J]. 水土保持研究, 2021, 28(1): 353–359.

[9] 韓張雄. 鉬礦區污染特征及伴生Pb、Cd的穩定化研究[D]. 楊陵: 西北農林科技大學, 2020.

[10] Wright S F, Frankesnyder M, Morton J B, et al. Time-course study and partial characterization of a protein on hyphae of arbuscular mycorrhizal fungi during active colonization of roots[J]. Plant and Soil, 1996, 181(2): 193–203.

[11] Purin S, Rillig M C. The arbuscular mycorrhizal fungal protein glomalin: Limitations, progress, and a new hypothesis for its function[J]. Pedobiologia, 2008, 51(2): 123–130.

[12] 曹夢, 唐中華, 趙龍, 等. 蘇打鹽堿化土壤pH與團聚體中球囊霉素相關土壤蛋白含量的關系[J]. 土壤, 2018, 50(2): 319–325.

[13] 肖玖軍, 邢丹, 毛明明, 等. AM真菌對桑樹根圍土壤團聚體的影響機制[J]. 土壤學報, 2020, 57(3): 773–782.

[14] 張夢歌, 石兆勇, 楊梅, 等. 熱帶山地雨林土壤球囊霉素的分布特征[J]. 生態環境學報, 2020, 29(3): 457–463.

[15] 馬潔怡, 王金平, 張金池, 等. 沿海造林樹種根際叢枝菌根真菌與土壤因子的通徑分析[J]. 南京林業大學學報, 2019, 43(4): 139–147.

[16] 張亞娟, 賀學禮, 趙麗莉, 等. 塞北荒漠植物根圍球囊霉素和生態化學計量特征的空間分布[J]. 環境科學研究, 2017, 30(11): 1723–1731.

[17] 張威, 劉寧, 呂慧捷, 等. TruSpec CN元素分析儀測定土壤中碳氮方法研究[J]. 分析儀器, 2009(3): 46–49.

[18] 魯如坤. 土壤農業化學分析方法[M]. 北京: 中國農業科技出版社, 2000.

[19] David P, Janos A, Sara G. Glomalin extraction andmeasurement[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2008, 40(3): 728–739.

[20] 楊皓, 胡繼偉, 黃先飛, 等. 喀斯特地區金刺梨種植基地土壤肥力研究[J]. 水土保持研究, 2015, 22(3): 50–55.

[21] 畢銀麗, 江彬, 秦芳玲, 等. 干旱半干旱煤礦區聯合接菌對土壤改良動態生態效應[J]. 農業工程學報, 2021, 37(7): 85–93.

[22] 陳海濱, 陳志彪, 陳志強, 等. 不同治理年限的離子型稀土礦區土壤生態化學計量特征[J]. 生態學報, 2017, 37(1): 258–266.

[23] Tian H Q, Chen G S, Zhang C, et al. Pattern and variation of C: N: P ratios in China's soils: A synthesis of observational data[J]. Biogeochemistry, 2010, 98(1/2/3): 139–151.

[24] 山寶琴, 李茜, 楊燕. 陜北石油污染對土壤球囊霉素含量的影響[J]. 環境工程學報, 2017, 11(11): 6155–6162.

[25] Cornejo P, Meier S, Borie G, et al. Glomalin-related soil protein in a Mediterranean ecosystem affected by a copper smelter and its contribution to Cu and Zn sequestration[J]. The Science of the Total Environment, 2008, 406(1/2): 154–160.

[26] 謝靖, 唐明. 黃土高原紫穗槐叢枝菌根真菌與土壤因子和球囊霉素空間分布的關系[J]. 西北植物學報, 2012, 32(7): 1440–1447.

[27] 胡家欣, 彭思利, 張棟, 等. 氮添加對不同林齡楊樹人工林叢枝菌根真菌群落的影響[J]. 生態環境學報, 2020, 29(9): 1768–1775.

[28] Hou E Q, Chen C R, Wen D Z, et al. Phosphatase activity in relation to key litter and soil properties in mature subtropical forests in China[J]. The Science of the Total Environment, 2015, 515/516: 83–91.

[29] 權常欣, 馬玲玲, 林釗凱, 等. 廣東省森林球囊霉素相關土壤蛋白含量及影響因素[J]. 生態環境學報, 2020, 29(2): 240–249.

Effect of Molybdenum Mining on Glomalin Related Soil Protein and Soil Stoichiometric Characteristics

ZHANG Mengge1, YIN Kejing1, SHI Zhaoyong1,2,3*, JIAO Yang1

(1 College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang, Henan 471023, China; 2 Luoyang Key Laboratory of Symbiotic Microorganism and Green Development, Luoyang, Henan 471023, China; 3 Henan Rural Human Settlement Environment Engineering Center, Luoyang, Henan 471023, China)

The rhizosphere soil in Mo-mining area was taken as the research object, and the influence of Mo-mining on soil glomalin, stoichiometry characteristics and their relationship were explored. The results showed that soil C and N contents in the mining area were 25.30 g/kg and 1.00 g/kg, respectively, which were significantly lower than those in the recovery and virgin areas. Soil C/N reached 29.36 in the mining area, which was 2.02 and 1.30 times of those in the recovery and virgin areas, respectively. Soil total glomalin (TG) contents were 2.81 and 3.64 mg/g in the recovery and virgin areas, respectively, while easily-extracted glomalin (EEG) contents were 1.22 and 2.02 mg/g, respectively, which were 2.08, 2.70 times and 1.97 and 3.26 times of TG and EEG in the mining area, respectively. In addition, the results of regression analysis showed that soil C and N contents had a significant effect on the secretion of glomalin-related soil protein (GRSP) by arbuscular mycorrhizal fungi. It can be seen that Mo-mining mainly has led to a large loss of soil C and N, and has a significant inhibitory effect on the secretion of GRSP by arbuscular mycorrhizal fungi.

Molybdenum mining soil; Different mining degrees; Soil ecological stoichiometry; Glomalin-related soil protein (GRSP)

S154.36; X144

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.011

張夢歌，尹可敬，石兆勇, 等. 鉬礦開采對球囊霉素相關土壤蛋白和土壤化學計量特性的影響. 土壤, 2022, 54(3): 517–523.

國家自然科學基金項目(32171620，31670499)、河南省科技攻關項目(192102110128)和SRTP項目(202010464067，2020337)資助。

(shizy1116@126.com)

張夢歌(1994—)，女，河南駐馬店人，博士研究生，主要研究方向為土壤微生物多樣性。E-mail: mgz8928@163.com