靈芝提取物對帕金森病模型細胞凋亡的保護作用

黃茜任志麗

（1.重慶城市管理職業學院智慧康養學院，重慶401331； 2.首都醫科大學宣武醫院，國家老年疾病臨床醫學研究中心，北京100053）

帕金森病是中老年人常見的神經退行性疾病之一，也是中老年人最常見的運動功能障礙性疾病，其主要病理特點為黑質紋狀體通路的多巴胺能神經元發生退行性病變減少和死亡，使神經遞質多巴胺水平下降，主要臨床表現為運動功能障礙，包括靜止性震顫、運動遲緩、肌張力增高和姿勢不穩等［1］。目前治療帕金森病的藥物大多通過增加腦內多巴胺水平或模擬多巴胺效應來控制癥狀，但長期服用存在較大的不良反應，并在使用一定時間后會出現療效減退及遠期副作用。

我國傳統中藥靈芝，被歷代醫藥家尊為“滋補強壯、扶正固本”的神奇珍品，對人體具有雙向調節作用，涉及心腦血管、消化、神經、內分泌、呼吸、運動等系統，尤其對腫瘤、肝臟病變、失眠、衰老的防治作用最為顯著［2-4］。研究發現，靈芝多糖的抗氧化作用，可以減輕神經毒素對多巴胺能神經元的損傷［5-6］。

本研究將采用小鼠神經瘤細胞neuro-2a，通過多巴胺能特異性神經毒素MPP＋損傷，抑制線粒體復合物I，觀察靈芝提取物對MPP＋損傷線粒體功能的影響，并從細胞凋亡的角度探究靈芝可能發揮的作用機制。

1 材料

1.1 細胞 neuro-2a 小鼠腦神經瘤細胞，購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。

1.2 試劑與藥物 靈芝提取物由培力（南寧）藥業有限公司提供，批號為A1800775，其中靈芝多糖約為98.1 mg／g，占10%。1-甲 基-4-苯基吡啶離子（MPP＋），購于美國Sigma 公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購于日本Dojindo公司；JC-1 線粒體膜電位檢測試劑盒，購于美國Biotium 公司；活性氧檢測試劑盒、ATP 檢測試劑盒，購于上海碧云天生物技術有限公司；Cytochrome C 抗體，購于英國Abcam公司；caspase-3抗體、caspase-9 抗體，購于美國Cell Signaling Technology 公司。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 用含有10%胎牛血清的DMEM 培養基培養neuro-2a 小鼠腦神經瘤細胞，并置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。按照1∶3 比例傳代，2～4 d 傳1 代。利用細胞計數板調整細胞密度，將細胞接種于合適的培養皿或培養板中。實驗共分3組，正常組（加入PBS 和靈芝提取物溶解介質）、模型組（加入1 mmol／L 溶于PBS 的MPP＋和相應體積的靈芝提取物溶解介質）、靈芝提取物組（加入1 mmol／L 溶于PBS 的MPP＋和800 μg／mL 溶解于相應培養基的靈芝提取物）。

2.2 細胞活性檢測 收集對數生長期neuro-2a 細胞，調整細胞密度為1×105／mL，每孔100 μL 接種于96 孔板（邊緣孔用相應培養基填充）。5%CO2、37 ℃孵育至細胞穩定貼壁，細胞單層鋪滿孔底時，各孔加入相應藥物，并設置3～5 個復孔。同時設置調零孔（培養基），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養基）。重新更換培養基，小心吸除孔內培養液，每孔加入100 μL 用相應培養基新鮮配制的CCK-8 溶液，于培養箱繼續孵育2 h，采用1 mmol／L MPP＋培養48 h，同時給予100、200、400、800 μg／mL 靈芝提取物，使用酶標儀在450 nm 波長處檢測吸光度，計算細胞存活率。

2.3 線粒體膜電位檢測 取對數生長期的neuro-2a 細胞進行線粒體膜電位（MMP）觀察，調整細胞密度為2×105／mL，分組及培養方法同“2.1”項，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養12 h后，進行JC-1 熒光染色。首先將含有10%FBS 的DMEM 高糖培養基預先平衡至室溫，用相應培養基稀釋熒光染料JC-1 至1×，吸棄培養板中培養基，PBS 清洗1次，每孔加入200 μL 含有JC-1 的培養基，放入培養箱孵育30 min，棄培養基，PBS 清洗2次，去除未結合的熒光染料，熒光倒置顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4 細胞免疫熒光染色 細胞按“2.1”項下方法進行分組給藥培養12 h后，將培養基吸出后，PBS 清洗3次，4%多聚甲醛固定15～30 min，0.3% Triton X-100 和0.01 mol／L PBST 清洗3次，滴加10%胎牛血清封閉液，室溫封閉1 h，傾去，勿洗，滴加一抗 ［cytochrome C（1∶400），LC3B（1∶ 1 000）］，4 ℃孵育過夜，PBS清洗3次，每次10 min；滴加二抗，37 ℃孵育1 h，PBS 清洗3次，每次10 min，滴加DAPI 復染，作用1 min，再滴加抗熒光淬滅封片劑。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.5 Western blot 法檢測相關蛋白表達 收集各組細胞，用RIPA 裂解液提取蛋白，并測定蛋白濃度。采用SDSPAGE 凝膠電泳后，進行轉膜，PVDF膜，200 mA 恒流電轉1.5 h，加入5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，去除封閉液，加入一抗，4 ℃過夜孵育，TBST 洗膜，加入相應二抗，室溫孵育1 h，使用ECL 發光法顯影，目的蛋白相對表達量以目的條帶灰度值與β-actin 灰度值的比值表示。

2.6 統計學分析 通過SPSS 11.5 軟件進行處理，Sigmaplot 繪圖軟件作圖，結果以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 靈芝提取物對MPP＋誘導neuro-2a 細胞活性的影響 與正常組比較，模型組neuro-2a 細胞活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，800 μg／mL 靈芝提取物組neuro-2a 細胞活性升高（P＜0.05），見圖1。提示靈芝提取物能夠提高MPP＋誘導的neuro-2a 細胞活性。

圖1 靈芝提取物對MPP＋誘導neuro-2a 細胞活性的影響（， n＝3）

3.2 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞線粒體膜電位的影響 正常組除極少數細胞被染綠色外，紅色熒光幾乎布滿整個視野，表明正常細胞線粒體膜電位較高，JC-1以聚合物的形式存在于線粒體膜內，紅色熒光多且亮；與正常組比較，模型組neuro-2a 細胞JC-1 從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式，線粒體跨膜電位去極化，并且隨著損傷時間的延長，紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加，最終幾乎全部細胞都被染為綠色，表明線粒體膜電位降低，線粒體遭到嚴重破壞；與模型組比較，靈芝提取物組neuro-2a 細胞線粒體膜電位水平升高，表現為紅色熒光的增加和綠色熒光的減少，見圖2。提示靈芝提取物可以增加MPP＋誘導的neur-2a 細胞線粒體膜電位。

圖2 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞線粒體膜電位的影響（×200）

3.3 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞線粒體色素C 的影響 正常組細胞內細胞色素C 的綠色熒光與標記線粒體的紅色熒光基本重疊，表明細胞色素C 與線粒體共定位［7］；模型組細胞內細胞色素C 的綠色熒光呈彌散狀態，與線粒體紅色熒光不能共定位，表明細胞色素C 從線粒體釋放；靈芝提取物組細胞內這種“不共定位”的情況有所改善，見圖3。提示MPP＋可以誘導neuro-2a 細胞產生凋亡反應，并且靈芝提取物可以抑制MPP＋誘導的細胞色素C從線粒體的釋放。

圖3 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞線粒體色素C 的影響（×400）

3.4 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞cleavedcaspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／pro-caspase-9 表達的影響 與正常組比較，模型組neuro-2a 細胞cleavedcaspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／pro-caspase-9 表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，靈芝提取物組neuro-2a細胞cleaved-caspase-3／pro-caspase-3、cleaved-caspase-9／procaspase-9 表達降低（P＜0.01），見圖4。

圖4 靈芝提取物對MPP＋誘導的neuro-2a 細胞caspase-3、caspase-9 蛋白表達的影響（， n＝3）

4 討論

MPP＋能造成線粒體損傷［8］，因此本研究選用MPP＋誘導的細胞凋亡。ATP 的合成是線粒體功能的核心，起著至關重要的作用，特別是線粒體的產生及其生理功能在調節神經遞質的傳遞以及維持突觸可塑性方面尤為重要［9-10］。帕金森病患者腦中多巴胺能神經元細胞的丟失程度與這些細胞組中caspase-3 陽性神經元的百分比呈正相關，這種關聯在帕金森病動物模型中亦可觀察到，這表明表達caspase-3 的神經元比那些不表達的神經元對病理損傷過程更敏感。另外，電子顯微鏡觀察表明，caspase-3 激活先于帕金森病并且不是帕金森病中凋亡細胞死亡的結果［11］。

細胞凋亡是導致黑質紋狀體多巴胺能神經元丟失的主要原因［12-13］，與自噬對細胞存活的雙向調節作用不同，凋亡對細胞死亡的調節是單向性的，它能及時主動清除機體衰老及異常細胞發揮清道夫作用［14］。MPP＋作用后，引起caspase-3、caspase-9 活化，表現為活化亞基水平升高，因此，初步判斷caspase 家族在MPP＋介導的細胞凋亡過程中起著重要作用，其中caspase-3 為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。caspase-3 正常以酶原（32 kDa）的形式存在于胞漿中，在凋亡早期階段被激活，活化的caspase-3 由2 個大亞基（17 kDa）和2 個小亞基（12 kDa）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。本研究通過采用MPP＋損傷線粒體，導致細胞內線粒體膜電位下降和細胞色素C 釋放，從而促進caspase 通路介導的細胞凋亡。使用靈芝提取物干預后，不同程度、不同方面減輕了線粒體損傷，從而抑制了細胞凋亡，可能對于提高多巴胺能神經元生存率或者改善微環境具有特殊的意義［15］，也對于靈芝今后在帕金森病的應用和開發利用有著一定的借鑒作用。