HPLC 法同時(shí)測(cè)定山慈菇中3 種成分

謝典朱聰潘紅波李曉靜徐步斌*周斌*

（1.江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌330013； 2.海軍勤務(wù)學(xué)院，天津300450）

山慈菇是蘭科植物杜鵑蘭Cremastra appendiculata（D.Don）Makino、獨(dú)蒜蘭Pleione bulbocodioides（Franch）Rolef、云南獨(dú)蒜蘭Pleione yunnanensisRolfe 的假鱗莖，秋季采摘，摘棄莖葉洗凈泥沙，經(jīng)曬干或烘干后加工而成。山慈菇分布廣泛，在長(zhǎng)江以南、西北、西南等地區(qū)均有種植。山慈菇具有悠久的應(yīng)用歷史，最初記載于唐代《本草拾遺》，藥性甘、微辛、涼，歸肝、脾經(jīng)，有清熱解毒、化痰祛瘀的功效，可用于癰腫疔毒、瘰疬痰核等由皮膚炎癥或感染引發(fā)的外科疾病，蛇蟲咬傷等［1］。

從山慈菇中分離得到菲類、聯(lián)芐類、糖及糖苷類、萜類、甾體類［2-10］等成分。山慈菇具有抗腫瘤［11-17］、降壓［18-19］、抗菌［20-23］、抗痛風(fēng)［24-25］等藥理活性。在我國(guó)，山慈菇常與其他中藥配伍治療肺癌、肝癌、大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及抗痛風(fēng)治療。dactylorhin A、militarine、秋水仙堿是山慈菇中主要的活性成分，其中，dactylorhin A、militarine 屬于丁二酸芐酯苷類成分，能夠提高由于用藥導(dǎo)致缺損的老鼠記憶，降低腦部神經(jīng)損傷，具有延緩衰老和抗老年癡呆的作用［26-28］，秋水仙堿則具有良好的抗痛風(fēng)、抗腫瘤作用。

近年來(lái)，山慈菇的研究聚焦于抗腫瘤作用機(jī)制，同時(shí)dactylorhin A、militarine 和秋水仙堿的含量測(cè)定也分別有報(bào)道［29-32］。本研究首次建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定山慈菇中dactylorhin A、militarine、秋水仙堿的含量，以期為山慈菇藥材的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 KQ-3200DB 型超聲波清洗器（江西贛儀科技有限公司）；LR4000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph 公司）；2550 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；CP225D 型電子天平（十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo 公司）；中藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 dactylorhin A 對(duì)照品（批號(hào)256459-34-4，純度≥98%，成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司）；militarine（批號(hào)DST190724-025，純度≥98%）、秋水仙堿（批號(hào)DST190527-052，純度≥98%）對(duì)照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司）。山慈菇購(gòu)自云南省麗江市，由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鄧可眾副教授鑒定為正品。甲醇（上海晶純生化科技股份有限公司）；乙腈（汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 稱取dactylorhin A、militarine、秋水仙堿對(duì)照品適量，置于量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為0.097、1.006、0.541 mg／mL 溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液 將藥材粉碎，過(guò)30 號(hào)篩，稱取粉末0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇50 mL，靜置1 h，超聲（100 W，45 kHz）處理1 h，濾過(guò)，將濾液濃縮轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，定容，搖勻，即得。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 將“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液于200～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，發(fā)現(xiàn)dactylorhin A、militarine 最大吸收波長(zhǎng)均為224 nm，秋水仙堿最大吸收波長(zhǎng)為242 nm，但在224 nm 處也有較好吸收。因此，選擇224 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 色譜條件 DIKMA Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，10% A；10～40 min，10%～40% A；40～45 min，40%～10% A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)224 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.4 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品溶液各10 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，并分別以S／N＝3、S／N＝10 計(jì)算檢測(cè)限、定量限，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗(yàn) 吸取“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量（質(zhì)量濃度分別為dactylorhin A 29.9 μg／mL、militarine 83.5 μg／mL、秋水仙堿34.6 μg／mL），在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得dactylorhin A、militarine、秋水仙堿峰面積RSD 分別為0.64%、0.28%、0.27%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取藥材粉末0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、24 h 在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得dactylorhin A、militarine、秋水仙堿峰面積RSD 分別為0.62%、0.80%、1.04%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材粉末0.5 g，共6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得dactylorhin A、militarine、秋水仙峰面積RSD 分別為0.66%、0.79%、0.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取藥材粉末0.25 g，平行6份，按100%水平精密加入對(duì)照品溶液適量，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。2.10 樣品含量測(cè)定 精密稱取藥材粉末3份，每份0.5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

表3 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察不同流動(dòng)相體系（乙腈-水、甲醇-水）的分離效果，比較超聲法、回流法對(duì)于成分提取的效果。結(jié)果，以甲醇-水為流動(dòng)相體系所得的目標(biāo)峰理論塔板數(shù)低，militarine、秋水仙堿色譜峰分離度差，且基線不平穩(wěn)，而乙腈洗脫能力強(qiáng)、黏度低，可以提高色譜峰理論塔板數(shù)，使出峰提前，有效縮短進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)間，故選擇以乙腈-水為流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)不斷調(diào)整洗脫梯度，使得3 個(gè)目標(biāo)峰有較好的分離度。同時(shí)，進(jìn)行超聲和回流提取方式的比較，測(cè)得兩者相差不大，超聲提取簡(jiǎn)便、易操作、適用于多批次樣品提取，故選取超聲為提取方法。以乙腈-水為流動(dòng)相對(duì)3 種成分進(jìn)行分離和含量測(cè)定，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性、精密度和重復(fù)性。

4 結(jié)論

山慈菇有著悠久的藥用歷史，具有抗腫瘤、降壓、抗菌、抗痛風(fēng)等作用，開發(fā)潛力較大。本研究首次建立HPLC法對(duì)山慈菇中dactylorhin A、militarine、秋水仙堿進(jìn)行含量測(cè)定，該方法準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可為山慈菇的質(zhì)量控制提供參考。