HBV感染者外周血自然殺傷樣B淋巴細胞、自然殺傷細胞、B淋巴細胞亞群的變化及臨床意義

楊曉飛， 申煥君， 黃高鉑， 連建奇， 張 野

1 空軍軍醫大學第二附屬醫院(第四軍醫大學唐都醫院) 傳染病科， 西安 710038；2 西安交通大學第一附屬醫院 肝膽外科， 西安 710061

急性HBV感染可誘導多克隆病毒特異性細胞毒性T淋巴細胞增殖分化，殺傷病毒感染的肝細胞，在清除HBV的同時可造成嚴重肝損傷。慢性HBV感染可誘導機體免疫耐受，造成免疫逃逸，無法有效清除病毒，導致感染慢性化[1]。因此，HBV感染的臨床結局是病毒感染與機體免疫應答復雜相互作用的結果[2]。自然殺傷(natural killer，NK)樣B淋巴細胞是一類新鑒定的免疫細胞亞群，NKB淋巴細胞兼具NK細胞和B淋巴細胞的表型，通過分泌IL-12和IL-18調控NK細胞和固有淋巴樣細胞功能，在病原體感染早期即可發揮有效免疫調控和抗感染活性[3]。但有關NKB淋巴細胞在HBV感染中的分布和臨床意義罕見相關報道。本研究分析了HBV感染者中NKB淋巴細胞、NK細胞和B淋巴細胞亞群的變化和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年1月—2018年12月就診于唐都醫院傳染科的HBV感染者，包括急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)患者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者、無癥狀HBV攜帶者(asymptomatic HBV carrier，ASC)。AHB納入標準：(1)既往無乙型肝炎病史；(2)HBsAg陽性、HBV DNA陽性；(3)ALT水平升高超過5倍正常值上限；(4)抗-HBc IgM 陽性；(5)6個月內HBsAg和HBV DNA均陰轉。CHB患者納入標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[4]的診斷標準：(1)HBsAg陽性大于6個月；(2)HBV DNA陽性；(3)ALT水平超過2倍正常值上限。ASC納入標準：(1)HBsAg陽性、HBeAg陽性、HBV DNA陽性；(2)ALT水平在正常范圍內。所有患者既往均未接受抗病毒治療，年齡>18歲。對照組納入標準：(1)同時期在唐都醫院行健康查體者；(2)年齡>18歲；(3)既往無HBV感染病史和乙型肝炎家族史。排除標準：(1)合并其他嗜肝病毒感染或HIV感染者；(2)合并自身免疫性疾病、酒精性肝硬化、藥物性肝損傷者；(3)合并惡性腫瘤者；(4)合并失代償期肝硬化、肝衰竭、肝癌等終末期肝病者；(5)妊娠或哺乳期婦女。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑和儀器 淋巴細胞分離液購自美國Sigma公司。小鼠抗人CD3-FITC、小鼠抗人CD19-APCH7、小鼠抗人CD16-APC、小鼠抗人CD56-PerCP Cy5.5均購自美國BD公司。人IL-18和IFNγ酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購自武漢華美生物技術公司。IFNγ酶聯斑點吸附試驗(ELISPOT)檢測試劑盒購自瑞典Mabtech公司。FACS Aria Ⅱ流式細胞儀為美國BD公司產品。ELISA微孔讀板儀為美國伯樂公司產品。ELISPOT讀板儀為德國AID公司產品。

1.2.2 血漿和外周血單個核細胞(PBMC)的分離 清晨、空腹采集EDTA抗凝外周血靜脈血10 mL，于4 ℃、1000 r/min離心10 min分離血漿，凍存于-80 ℃備用。剩余血細胞立即使用淋巴細胞分離液、采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。使用0.4%臺盼藍對PBMC計數，以5×106個/管分裝在凍存管中，加入90%胎牛血清+10%二甲基亞砜凍存于液氮中備用。

1.2.3 流式細胞檢測免疫細胞亞群比例 復蘇PBMC，取106個PBMC，轉入FACS管中，洗滌2次后加入小鼠抗人CD3-FITC、小鼠抗人CD19-APC H7、小鼠抗人CD16-APC、小鼠抗人CD56-PerCP Cy5.5進行表面染色，4 ℃避光孵育30 min，洗滌后進行流式檢測。使用FACS Aria Ⅱ流式細胞儀檢測，BD FACS Diva軟件獲取細胞，FlowJo V10軟件分析結果。NKB淋巴細胞、NK細胞和B淋巴細胞的流式分析策略：首先根據前向角散射和側向角散射對淋巴細胞進行圈門，在淋巴細胞門內分析CD3-CD19+細胞，即為B淋巴細胞。在CD3-CD19+門內，分析CD16+CD56+細胞，即為NKB淋巴細胞。在淋巴細胞門內分析CD3-CD19-細胞，在CD3-CD19-門內，分析CD16和CD56表達，分析不同NK細胞亞群，包括：CD3-CD19-CD56highCD16-NK細胞、CD3-CD19-CD56+CD16+NK細胞、CD3-CD19-CD56-CD16+NK細胞(圖1)。

圖1 外周血NKB淋巴細胞、NK細胞、B淋巴細胞的流式分析策略

1.2.4 ELISA檢測血漿IL-18和IFNγ水平 使用商品化的ELISA試劑盒對血漿中IL-18和 IFNγ水平進行檢測，操作按說明書要求進行。

1.2.5 ELISPOT檢測HBV特異性CD8+T淋巴細胞分泌 IFNγ水平 使用抗IFNγ(0.5 μg/mL)包被96孔PVDF膜板，4 ℃孵育過夜，向每孔中加入105個PBMC(100 μL)和HBV全基因組多肽(15肽，每條多肽之間有5個氨基酸重疊，共313條；10 μg/mL)[5]，37 ℃、5%CO2條件下刺激培養16 h，洗滌后每孔加入100 μL生物素標記的抗IFNγ單抗，室溫孵育60 min，洗滌后每孔加入100 μL堿性磷酸酶標記的鏈球菌親和素，室溫避光孵育45 min，洗板后加入顯色劑反應15 min，終止反應后讀板，以斑點形成細胞數(spot forming cells, SFC)/106PBMC為單位計數產生IFNγ的細胞。

2 結果

2.1 一般資料 共納入AHB患者15例，CHB患者30例，ASC 29例，對照者12例。入組受試者一般資料見表1。

表1 入組受試者一般資料比較

2.2 HBV感染者外周血NKB淋巴細胞、NK細胞、B淋巴細胞比例和IL-18、IFNγ水平變化 CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細胞占淋巴細胞的比例在AHB患者、CHB患者、ASC和對照者之間的差異有統計學意義(F=16.42，P<0.000 1)，CHB患者NKB淋巴細胞比例[(0.79±0.13)%]顯著低于AHB患者[(0.94±0.15)%]、ASC[(1.02±0.12)%]和對照者[(1.11±0.27)%](P值均<0.001)(圖2a)。CD3-CD19-CD56highCD16-NK細胞、CD3-CD19-CD56+CD16+NK細胞、CD3-CD19-CD56-CD16+NK細胞以及B淋巴細胞占淋巴細胞的比例在AHB患者、CHB患者、ASC和對照者之間的差異均無統計學意義(F值分別為0.598、0.505、1.950、1.676，P值均>0.05)(圖2b～e)。血漿IL-18水平在AHB患者、CHB患者、ASC和對照者之間的差異有統計學意義(F=5.733，P=0.001)，CHB患者IL-18水平[(259.30±70.09)pg/mL]顯著低于AHB患者[(336.00±103.00)pg/mL]和對照者[(319.30±64.80)pg/mL](P值均<0.05)，ASC IL-18水平[(258.60±59.82)pg/mL]亦顯著低于AHB患者和對照者(P值均<0.01)，但血漿IL-18水平在CHB患者和ASC之間的差異無統計學意義(P=0.965)(圖2f)。血漿IFNγ水平在AHB患者、CHB患者、ASC和對照者之間的差異有統計學意義(F=4.737，P=0.004)，CHB患者IFNγ水平[(11.79±2.47)pg/mL]顯著低于AHB患者[(14.55±3.81)pg/mL]、ASC[(13.79±2.82)pg/mL]和對照者[(14.50±2.42)pg/mL](P<0.01)(圖2g)。

注：a，CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細胞；b，CD3-CD19-CD56highCD16-NK細胞；c，CD3-CD19-CD56+CD16+NK細胞；d，CD3-CD19-CD56-CD16+NK細胞；e，B淋巴細胞；f，IL-18；g，IFNγ。

2.3 HBV感染者中NKB淋巴細胞與臨床指標相關性 AHB患者、CHB患者和ASC中NKB淋巴細胞和IL-18與HBV DNA定量、ALT水平均無相關性(P值均>0.05)。AHB患者和ASC中NKB淋巴細胞與IL-18水平無相關性(P>0.05)，CHB患者中NKB淋巴細胞占淋巴細胞的比例與血漿IL-18水平呈正相關(r=0.432，P=0.017)(圖3a)，CHB患者中NKB淋巴細胞占淋巴細胞的比例與血漿IFNγ水平無相關性(r=-0.018，P=0.923)(圖3b)，但CHB患者中NKB淋巴細胞比例與病毒特異性CD8+T淋巴細胞分泌IFNγ水平呈顯著正相關(r=0.493，P=0.006)(圖3c)。

注：a，NKB淋巴細胞比例與血漿IL-18水平相關性分析；b，NKB淋巴細胞比例與血漿IFNγ水平相關性分析；c，NKB淋巴細胞比例與病毒特異性CD8+T淋巴細胞分泌IFNγ水平相關性分析。

3 討論

本研究首次對新近鑒定的淋巴細胞亞群——NKB淋巴細胞在HBV感染者中的變化進行分析。NKB淋巴細胞雖然兼具NK細胞和B淋巴細胞的標記，在小鼠中的表型為CD3-CD19+NK1.1+[3]，在人類中的表型為CD3-CD19+(或CD20+)NKp46+[3,7-8]，但NKB淋巴細胞的功能卻尚未完全闡明。Kerdiles等[9]認為，雖然NKB淋巴細胞具有NK細胞的表型，但在功能上與傳統B淋巴細胞基本相似。但Wang等[3]則認為，NKB淋巴細胞主要通過分泌IL-18和IL-12在微生物感染早期階段活化NK細胞和固有淋巴樣細胞，發揮抗感染免疫活性，這一功能活性亦在猴免疫缺陷病毒感染中得到證實[10]。本課題組前期研究[8]發現，NKB淋巴細胞在牙周炎患者外周血和牙周組織中的水平均顯著升高，并主要通過分泌IL-18發揮促進牙周組織炎癥應答的作用。新近的研究[11]發現，原發性肝癌患者外周血和腫瘤浸潤NKB淋巴細胞比例及其分泌的IL-18水平均顯著降低。但有關NKB淋巴細胞在HBV感染中的數量和功能的變化尚未見相關報道。本研究應用經典NK細胞表型(CD3-CD16+CD56+)和B淋巴細胞表型(CD3-CD19+)對HBV感染者外周血中CD3-CD19+CD16+CD56+NKB淋巴細胞進行了檢測，結果發現，AHB患者和ASC外周血NKB淋巴細胞比例與對照者無顯著差異，但CHB患者中NKB淋巴細胞比例則顯著低于對照者。在對NKB淋巴細胞的標志性細胞因子IL-18的表達水平進行分析時亦發現，CHB患者和ASC中IL-18表達水平下降，這與既往研究[12]基本一致。

NKB淋巴細胞比例和IL-18水平與病毒復制、肝臟炎癥均無顯著相關性。由于既往的研究主要集中在NKB淋巴細胞在急性病毒感染中的作用，本研究未發現AHB患者中存在NKB淋巴細胞數量變化，提示NKB淋巴細胞可能并未直接參與急性HBV感染的病程。而ASC和CHB是慢性HBV感染自然史的2個不同階段，多數患者在青少年階段處于免疫耐受期，病毒處于高水平復制，肝臟炎癥應答輕，隨著疾病進展，機體免疫系統對感染病毒的肝細胞進行殺傷，清除病毒的同時誘導肝臟炎癥損傷[13-14]。因此，本研究入組的ASC較CHB患者年齡小，但NKB淋巴細胞和IL-18與年齡無顯著相關性。NKB淋巴細胞僅在CHB患者中降低，在ASC中無明顯變化，而IL-18在CHB患者和ASC中均顯著降低，但僅在CHB患者中NKB淋巴細胞與IL-18呈顯著正相關。這可能說明由于ASC患者處于免疫耐受階段，NKB淋巴細胞活性尚未受到抑制，ASC患者中其他分泌IL-18的細胞(如單核細胞、角質形成細胞等)亦可能被抑制，導致IL-18水平下降。而進入免疫清除期后，長期病毒持續感染仍可能導致免疫細胞失能，造成NKB淋巴細胞水平下降，其分泌的IL-18水平亦降低，不能清除病原體和誘導抗病毒免疫應答，加重病毒持續感染。因此，NKB淋巴細胞水平下降可能與HBV感染自然史密切相關。此外，CHB患者外周血中NKB淋巴細胞降低亦可能與疾病過程中NKB淋巴細胞向肝臟的募集浸潤有關。新近的研究[15]發現，肝癌患者中NKB淋巴細胞可通過分泌IL-18調控CD8+T淋巴細胞活性。本研究發現，NKB淋巴細胞比例與分泌IFNγ的HBV特異性CD8+T淋巴細胞水平呈顯著正相關，提示在CHB疾病過程中，NKB淋巴細胞也可能參與了病毒特異性CD8+T淋巴細胞功能調控。但本研究未納入ASC和CHB患者的肝穿刺標本，仍需要使用HBV轉基因小鼠模型進行研究加以證實。

本課題組既往研究[16]發現，HBV質粒高壓尾靜脈注射誘導的HBV感染小鼠模型肝臟中NK細胞比例與對照小鼠無顯著差異，本研究在HBV感染者中亦發現了相似的結果。NK細胞根據CD16和CD56表達水平可分為CD56highCD16-NK細胞、CD56+CD16+NK細胞、CD56-CD16+NK細胞。CD56highCD16-NK細胞通過分泌多種細胞因子參與機體免疫調控；CD56+CD16+NK細胞是成熟的、具有細胞毒性的NK細胞亞群，通過CD16發揮抗體依賴的細胞介導的毒性作用；CD56-CD16+NK細胞則是失能的NK細胞，分泌細胞因子和細胞毒性作用均顯著降低，增殖能力亦低下[17]。本研究發現，HBV感染者中三類NK細胞亞群比例與對照者均無顯著差異，這與既往發現NK細胞在AHB患者和CHB患者中受到抑制的趨勢不盡相同[18]，這可能與分析NK細胞不同亞型時采用的細胞表面標志不同有關。NK細胞通過分泌IFNγ介導后續適應性免疫活化促進HBV清除[19]，因此本研究亦對血清中IFNγ水平進行檢測，結果發現，CHB患者血漿IFNγ水平顯著降低，這與本課題組既往研究[20]結果一致，但與NK細胞亞群變化趨勢不盡相同，這可能由于NK細胞并非為血漿中IFNγ的唯一細胞來源有關。既往有研究[21-22]發現HBsAg和HBeAg可誘導成熟的NK細胞功能活性下降，導致HBV感染者疾病進展，促進失代償期肝硬化、肝癌等終末期肝病發生。B淋巴細胞在HBV感染過程中發揮誘導抗病毒抗體產生、抗原提呈等多種功能[23]，但本研究中亦未發現HBV感染者和對照者外周血B淋巴細胞比例存在明顯差異。因此，HBV感染者中NK細胞和B淋巴細胞功能的變化仍有待進一步研究。同時，本研究為橫斷面研究，針對AHB患者和CHB患者未進行治療前后不同免疫細胞亞群的比較，這也是本研究的薄弱環節之一。

綜上所述，慢性HBV感染可能誘導NKB淋巴細胞水平下降，NKB淋巴細胞及其分泌的IL-18參與HBV感染慢性化，與慢性HBV感染自然史相關。

倫理學聲明：本研究方案于2015年5月21日經由空軍軍醫大學第二附屬醫院(第四軍醫大學唐都醫院)倫理委員會批準，批號：TDLL-201505-013，所有入組受試者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：楊曉飛、申煥君、黃高鉑負責實驗操作和論文撰寫；楊曉飛、連建奇、張野負責數據分析；連建奇、張野負責入組患者、課題設計、指導論文撰寫并最后定稿。