肝豆狀核變性家系全基因組分析1例報告

胡亞欣， 程 卓， 叢 碩， 劉詠梅， 張寶芳， 雷 榆， 嚴 昭，張懿煒， 蒲 茜， 余 蕾， 程明亮

1 貴州醫科大學附屬醫院a.產前診斷中心， b.輸血科， c.檢驗科， d.感染科， 貴陽 550004；2 北京大學第三醫院消化科， 北京 100191； 3 貴州醫科大學研究生院, 貴陽 550004；4 貴陽市婦幼保健院， 貴陽 550004

肝豆狀核變性又稱Wilson病，是由于銅轉運蛋白相關基因ATP7B的突變或缺失而導致銅在體內蓄積而引起的疾病，遺傳模式為常染色體隱性遺傳[1]。臨床表現為肝臟損害、神經系統表現、腎臟損傷、出現角膜K-F環等，涉及機體多個系統和器官，以肝臟或神經系統的損傷為主要表現形式。ATP7B 基因定位于人類染色體13p14.3 上，具有21個外顯子區域[2]。目前已發現的有害基因突變有800余種(人類基因突變數據庫www.hgmd.org)。研究表明，不同的基因突變位點與不同的臨床表現相關。

1 病例資料

先證者(圖1，箭頭所示)，男，40歲。于15歲時，出現口齒不清、流涎、步態不穩等癥狀，角膜K-F環陽性，被診斷為肝豆狀核變性，規律服用青霉胺治療后，癥狀逐漸得到控制；血清銅2.20 μmol/L，尿銅1130 μg/24 h。查問家族史，先證者有3個姐妹，其中2個在青少年時期死亡。姐姐在10余歲時，死于劇烈運動誘發的肝衰竭；一個妹妹也在童年時期出現高燒及惡性黃疸，經治無效死亡。由于當時的診療條件有限，未能明確診斷，但結合二者病史特點臨床高度疑似肝豆狀核變性。先證者另一位妹妹(圖1，Ⅱ5)，在先證者確診后，也進行了基因檢測，結果與先證者ATP7B基因突變相同。先證者父親尿銅112 μg/24 h，輕度升高，無其他臨床表現；母親尿銅31 μg/24 h，屬于正常范圍；妹妹139 μg/24 h，輕度升高，無相關臨床癥狀。

圖1 患者家族系譜圖

經對該家系進行全基因組測序分析，發現先證者及其妹妹均有來自于父親的c.2304dupC及來自于母親的c.2975C>T兩個突變。前者是一個罕見的突變，后者在東亞為一個熱點突變[3]。已有報道[4]，先證者與一健康女子結合，婚后反復4次自然流產。健在的妹妹33歲，無肝豆狀核變性的任何癥狀，檢查發現尿銅輕度升高，同其父相似。為了探究先證者及其妹妹具有相同基因型，但表型不同的原因，筆者對該家系進行了全基因組基因測序、GO及KEGG分析，以明確兄妹二人的基因組差異。

1.1 高通量測序 提取樣品后，通過嚴格的質檢，將合格后的樣品DNA片段隨機打斷，構建文庫，添加adaptor，PCR擴增，然后利用illumina機器進行測序。去除低質量序列，得到最終的clean reads，分析SNP、Indel、CNV、SV 變異，并用軟件對結果進行注釋。涉及到的軟件包括BWA(Burrows-Wheeler Aligner)0.7.5a-r405、Samtools( Sequence Alignment/Map Tools) 0.1.19、Picard-Tools 1.57、Genome Analysis Toolkit 2.5-2-gf57256b、pindel-v0.2.2、SnpEff、Annovar、KOBAS 2.0、topGO、CREST、CNVnator等。測序深度達到10X的覆蓋比例均在99%以上，達到20X的覆蓋比例為93.57%以上。在數據庫中比對匹配比例92.72%以上。

1.2 罕見基因突變分析 篩選過濾已知數據庫(千人數據庫、400Kberry、ESP6500)，過濾掉高頻位點(頻率>5%)的突變，并對銅離子吸收代謝過程中的直接或間接相關基因ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA、SOD1等進行逐個分析比對。在家系中共發現了15 865個罕見基因位點突變，3667個indel短序列插入或缺失片段，4148個CNV變異，以及1044個SV變異。對銅離子代謝相關基因突變進行逐個分析，發現先證者的ATP7A、ATP7B、ADNP、APOA4、ATOX1、CCS、COX17、COX11、PAM、PRND、SNCA等多個銅代謝相關基因發生了突變，大部分突變無明確致病性，且某些突變發生在內含子上。筆者繼續對非同義突變的SNP位點所在的基因，用topGO軟件對目標基因進行GO富集分析。

1.3 GO和KEGG分析 GO分析顯示雖然兄妹二人在致病基因ATP7B上的突變位點相同，但是在全基因組層面富集的SNP顯示了二人在生物過程、分子功能、細胞組分上的差異。根據P值的大小，列出了前15個差異顯著的條目，值得注意的是，先證者在基于Indel的GO分析，與銅離子結合的分子功能(GO:0005507)上，有明顯差異，P值為0.014 56；而先證者妹妹前20個GO差異里則不包含這一項目(圖2)?；蛲蛔兣c臨床表型之間有著復雜的基因調控機制，尚需要進一步研究。

注：a，先證者妹妹的基因突變富集的GO分子功能分析；b，先證者基因突變富集的GO分子功能。

2 討論

人體每天從食物中吸收2～5 mg的銅離子，大部分在體內經過銅藍蛋白轉運至各個部位，多余的銅離子經膽汁排泄，通常情況下尿銅不超過50 μg/24 h。多個基因參與了銅離子的吸收和代謝。首先，細胞通過hCTR1吸收銅，一系列銅伴侶分子(ATOX1、CCS、COX17等)將銅離子運送至各個組織器官[3]。ATOX1與ATP7B相結合，調控ATP7B的N-末端活性[5]，同時其也可以調控ATP7B在細胞內的位置等[6]。ATP7B基因編碼P型銅轉運ATP酶，主要在肝臟中高表達，通過金屬結合位點與銅離子結合，將銅離子從胞質轉運至高爾基體，并將過量的銅從肝臟通過膽汁排泄。正常生理狀態下，ATP7B蛋白在高爾基體反面網絡中聚集，轉運胞質中由ATOX1蛋白傳遞而來的銅離子，這些銅離子將用于血漿銅藍蛋白的生物合成；當銅離子濃度增加到一定程度之后，ATP7B蛋白從高爾基體反面網絡上解離，向肝細胞面的膽小管移動，通過膽汁將多余的銅排出體外[7]。若ATP7B基因突變，則導致銅離子外排通路障礙，銅離子超載，在細胞內蓄積。

肝豆狀核變性作為ATP7B基因突變導致的單基因遺傳病，其發病規律與基因突變位點關系密切，其發病年齡常在10～30歲[8]。不同位點突變對ATP7B功能的影響存在差異，并可能與不同的臨床表現相關。ATP7B基因突變在亞洲人群中最常見的突變是p.Arg778Leu，歐美人群中為p.His1069Gln[9]。研究[10]發現，p.L492S、p.V519M、p.E541K、p.L549P、p.A604P、p.R616W、p.P992L、p.N1270S等突變往往預示著發病年齡較早，而具有p.I1148T突變的患者則大多在12歲后發病。本案例中兄妹二人均攜帶來自母源的p.P992L這一突變，先證者和其已故姐妹的發病年齡均為10～15歲，符合上述觀點。先證者小妹同樣攜帶這一突變，在33歲仍未發病。由圖3可以看出，該2個位點突變的部位在ATP結合域之前，分別在第4和第6跨膜結構上，其中一個來自父親的突變c.2304dupC為移碼突變，可能會造成該蛋白的功能完全喪失，這可以用來解釋先證者父親尿銅升高。但不排除其他多種可能性導致這種情況發生，比如銅離子的攝入不足(限銅飲食)、排出增加、機體對銅離子的耐受程度等。

圖3 ATP7B結構及患者突變所在位置

在相同的基因型的情況下，盡管起病癥狀可能不同，但是發病年齡常較為相近[11-13]。但是也有些許個例，兄弟姐妹的發病年齡差異很大。曾有文獻[10]報道了一對姐弟，姐姐于72歲因亞急性肝衰竭和神經功能癥狀而被確診，弟弟45歲開始出現輕微手部震顫，但因癥狀較輕而被忽略，在姐姐確診后才診斷為肝豆狀核變性，二人驅銅治療后癥狀均有改善。之前也有過同一家庭內有孩子16歲發病后，其姐姐38歲發病的報道。筆者推測可能和等位基因的表達優勢相關[14]。上述報道均為弟弟先發病，而姐姐遲發，存在性別差異。肝豆狀核變性男女患病概率相同，但是癥狀仍然具有性別差異：男性更易出現神經癥狀；女性常首先出現肝損害，出現神經癥狀更晚[2]。這種現象可能與雌激素對神經的保護作用有關。

在本例家系中，相同基因型的兄妹間表現出了銅代謝指標及發病情況的極大差異。肝豆狀核變性的臨床表型受多種因素的影響[15]，ATP7B基因突變類型只是其中一部分。目前已研究的潛在影響因素包括修飾基因如ApoE[16]、MTHFR[17]、銅代謝MURR1結構域1[18]、氧化應激過程中的酶[19]、DNA甲基化以及飲食中的膽堿[20-21]、雌激素的保護作用等，均能影響肝豆狀核變性的病情輕重。動物實驗[19]表明，肝豆狀核變性小鼠模型的低甲基化狀態可由增加攝食中的膽堿含量而恢復至正常水平，同時肝臟病變有所改善。但在人類疾病過程中，甲基化對表型影響的程度尚無確切的報道。

肝豆狀核變性不同臨床表型與性別、飲食、修飾基因、甲基化調控等多種因素相關，期待未來有更多的研究加以關注，并為肝豆狀核變性帶來更多的治療方式。

倫理學聲明：本例報告已獲得患者知情同意。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：胡亞欣、余蕾對研究的思路或設計有關鍵貢獻；張寶芳、程卓、叢碩、劉詠梅、雷榆、蒲茜、嚴昭、張懿煒負責研究數據的獲取分析；胡亞欣、程卓參與起草和修改文章關鍵內容；程明亮負責審核并最終定稿。