植物組織培養技術在藏藥中的應用研究進展

梁翠婷，劉 蘭，劉 繼，旦增頓珠，張勇倉*

(1.西藏大學 醫學院，西藏 拉薩 850000；2．成都市農林科學院，四川 成都 611130)

藏藥作為我國四大民族藥之首，發展至今已有兩千多年的歷史，藏藥因其獨特的用藥風格及療效，深受人們信賴。藏藥品種豐富，據文獻記載共有植物藥2 685種，其中菌類50種，地衣類6種，苔蘚類5種，蕨類118種，裸子植物47種，3變種，被子植物1 895種，141變種，另有動物藥159種，礦物藥80余種[1-2]。盡管我國藏藥資源豐富，但近年來，隨著藏醫藥產業發展，市場對藏藥的需求量逐漸增加，致使藏藥被無規劃地大量采挖，加之其生長環境地處高原，常年降雨量較少，氣溫低等原因，使得藏藥具有生長緩慢、資源量少、物種分布不均等特點，因此許多藏藥在市場上供不應求，甚至成為瀕危物種。目前已有74種藏藥被列入《中國珍稀瀕危植物》，其中，一級瀕危藏藥11種，二級瀕危藏藥21種，三級瀕危藏藥42種[3-4]。因此，既保護好藏藥的現有資源，又能滿足市場需求就成為亟待解決的問題，針對這一情況，有學者提出了對藏藥資源進行定期普查、就地保護、建立藏藥種質資源庫、開展人工種植、加強民眾對藏藥的保護意識等相關解決方法[4-5]。

植物組織培養指在無菌條件下，將植物的離體器官，如根、芽、莖、葉等外植體接入至培養基中，通過人為控制生長環境，對離體器官進行培養，外植體經過脫分化、再分化、誘導生根形成完整植株的一系列過程。自1920年德國植物學家Haberlandt提出細胞具有全能性學說至今，植物組織培養技術已日趨成熟，并被廣泛應用于農業、花卉業、藥用植物等多個領域[6-7]，因該技術具有繁殖系數高，縮短育種周期，快速獲得目標物等優點，無疑是解決當前瀕危藏藥資源短缺問題的有效手段[8]。近年來，植物組織培養技術在藏藥植物中的應用日益增多，本研究從該技術在藏藥研究中的應用、藏藥組織培養體系建立途徑、影響因素、存在問題等方面進行綜述，為今后藏藥的搶救性保護和可持續發展提供參考。

1 植物組織培養技術在藏藥研究中的應用

1.1 通過組織培養技術獲得大量無菌植株

藏藥植物因長期適應高寒缺氧環境，形成了種群更新較慢的特點，加之氣候復雜多變，環境荒漠化等使其生存環境易受到破壞，造成藏藥資源量減少的困境[9]，而組織培養技術具有繁殖系數高的優點，可在一定程度上獲得大量植株[10]。澤仁旺姆對藏藥白花秦艽進行組織培養，篩選出最好的分化培養基，繁殖系數高達2 000[11]。楊爽等[12]以一級瀕危藏藥雞蛋參的嫩莖為實驗材料發現，當添加ZT(玉米素)的濃度為2.0 mg/L時，雞蛋參腋芽的增殖系數達到4.86，在繼續添加了NAA 0.05 mg/L，ZT 1.0 mg/L的培養基中對腋芽進行培養，此時無菌苗增殖系數達到了5.44。曾鈺婷等[13]在螃蟹甲的組織培養研究中發現，螃蟹甲的無菌苗在添加了不同濃度的6-BA培養基中培養，單株植株可分化出3～7個植株，進一步誘導生根可獲得生長健康的完整植株。這些研究為緩解藏藥資源的稀缺狀況奠定了一定基礎。

1.2 通過組織培養技術獲得活性成分

藏藥材的活性成分種類豐富，但在整體植株中的占比較少，且很多藏藥材資源量稀少，因而從保護性開發角度看，提高藏藥材中活性成分無疑是保護藏藥的又一有效途徑[5]。近年來，眾多科研人員致力于提高藏藥材的活性成分，王莉等[14]以林芝地區的長鞭紅景天為材料研究發現，以MS培養基為基本培養基，添加6-BA 5.0 mg/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸) 0.1 mg/L的條件最適宜長鞭紅景天細胞生物量的生長，以及次生代謝物的合成。郭志剛等[15]先采用固體培養基誘導藏紅花愈傷組織，再將愈傷組織轉移至液體培養基中快速合成藏紅花素，該方法克服了愈傷組織形成過程中，藏紅花素抑制細胞生長的缺點，又實現了藏紅花素的快速生物合成。研究發現，通過添加殼聚糖、殼寡糖、茉莉酸甲酯、水楊酸等對藏紅花中藏紅花素合成的影響發現，添加了100 μmol/L的茉莉酸甲酯組藏紅花素的含量達到28.57 mg(1 g干細胞計)[16]。

2 藏藥組織培養體系建立途徑

2.1 間接器官發生途徑

間接器官發生指通過對外植體進行愈傷組織誘導，再經過脫分化形成不定芽，通過不定芽的增殖，進一步誘導生根，馴化形成完整植株的過程[17-18]。瀕危藏藥自身材料較難獲得，而間接器官的發生途徑不局限于某個外植體，可選任何組織進行培養誘導，這極大降低了取材困難程度，因此在瀕危藏藥組織培養中，多數以間接器官進行培養。李展等[19]通過以藏藥纖毛婆婆納的頂芽為材料，MS為培養基，在添加6-BA 0.5 mg/L和NAA 1 mg/L時纖毛婆婆納愈傷組織誘導率達95%。李茜茹等[20]在當藥的組織培養中，以嫩芽為外植體，MS為培養基，通過添加ZT 0.3 mg/L、2，4-D 2.1 mg/L，愈傷組織誘導率達83%。陳序昉等[21]以多刺綠絨蒿的嫩葉為外植體，以MS為基礎培養基，添加NAA 0.1 mg/L和6-BA 1 mg/L為誘導多刺綠絨蒿愈傷組織的最適宜組合。霍麗云等[22]以高寒藏藥白花假龍膽的胚軸、幼葉及未成熟種子為外植體誘導愈傷組織發現，添加了2，4-D 3.0 mg/L和KT 0.5 mg/L的MS培養基中愈傷誘導率達到最高，將愈傷組織進行繼代培養，再經過誘導生根等可獲得無菌苗。

2.2 直接器官發生途徑

直接器官發生是通過對具有生長點的外植體進行誘導，直接形成不定芽，不經過脫分化形成愈傷組織的步驟。直接器官發生建立組織培養體系較快，可直接獲得不定芽，通過不定芽的增殖，達到組織培養過程中增殖系數倍增的目的[17]。畢麗偉等[23]以雞蛋參的莖段為外植體，1/2 MS為基本培養基，通過添加6-BA 0.5 mg/L和IBA 0.2 mg/L直接誘導出芽，再接入生根培養基誘導生根，從而獲得雞蛋參的無菌苗。澤仁旺姆等[24]以拉薩奪底溝的藏紫草莖尖為材料，在MS培養基中添加了6-BA 0.5 mg/L與IBA 0.5 mg/L，此時藏紫草的不定芽增殖系數為5，再對不定芽進行繼代和生根培養，可獲得藏紫草的完整植株。徐文華等[25]以馬尿泡芽為外植體，在MS培養基中添加6-BA 2 mg/L和NAA 1 mg/L時芽的分化率為100%，繼續進行生根培養即獲得完整植株。

3 藏藥組織培養體系建立的影響因素

3.1 外植體選擇

不同植物所選擇的外植體部位有所不同，外植體是否誘導成功，是組織培養能否順利進行的關鍵。徐文華等[26]在對唐古特大黃進行組織培養的研究中發現，唐古特大黃的子葉、下胚軸、胚根和幼根均可進行分化。鐘世浚等[27]在添加了ZT的MS培養基中對紅花龍膽的葉片及帶節莖段進行篩選，發現白花龍膽的葉片嚴重褐化，但帶節莖段則可進行增殖產生不定芽。王慧春等[28]對瀕危藏藥獨一味進行了組織培養研究發現，在以嫩芽、子葉、幼根為外植體時，幼根在添加了2，4-D 1.0 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L的MS培養基中的誘導率高達93.5%。作者對現有文獻進行了整理，將藏藥中常用外植體的部位，以及所需的培養基與激素種類歸納見表1。

表1 外植體類型及培養條件

3.2 消毒方法

雖已有研究人員進行了開放式培養研究，但絕大多數植物組織培養仍需無菌條件。而藏藥的生存環境復雜，一般在野外獲取，通常攜帶有大量的微生物或內生菌，如何將外植體攜帶的病原微生物清除干凈，是組織培養的關鍵，綜合相關文獻看，常用的消毒劑主要為次氯酸鈉、氯化汞等溶液。一般步驟為先在流水下將野外獲得的植物外植體所帶雜質清洗干凈，再在無菌條件下用75%乙醇進行30～60 s消毒，無菌水沖洗3～5次，最后用氯化汞、次氯酸鈉等消毒劑對外植體進行消毒處理，以無菌水沖洗干凈。對于較難消毒的外植體，采用聯合消毒的方法可取得較好的除菌效果，如在消毒劑中加入吐溫，可增加消毒劑與外植體表面接觸的概率，使消毒更徹底[28，32，36]。研究發現，在常規滅菌前用紫外線照射，可明顯降低污染率。藏藥的組織培養中常用消毒劑及消毒時間見表2。

表2 消毒劑類型

3.3 培養基及培養條件

培養基是植物組織培養時外植體的主要營養來源，培養基成分為大量元素、微量元素、鐵鹽元素及有機物，常用的培養基有MS、1/2 MS、1/4 MS、B5、White等，其成分與細胞生長速度關系密切，如Manuhara等[41]發現培養基中添加蔗糖相較于對照組，可加速細胞的生長速度，而適當添加氮源則有利于植物中生物量的積累[42]。對現有藏藥組織培養文獻進行歸納發現，藏藥的組織培養在誘導愈傷組織及叢芽分化時期，通常以MS培養基為主，在誘導生根時期以1/2 MS為主(見表3)。在植物組織培養中，激素的種類和配比與外植體的生長方向、生理反應及生長分化有關[17]，藏藥組織培養中常用的激素類型有6-BA、NAA、KT、IBA等。現將部分瀕危藏藥組織培養的培養基及培養條件歸納如表3所示。光照、溫度、pH等與植物細胞的生長及次生代謝的合成關系密切，也可在一定程度上影響細胞的生物積累量[43-44]。

表3 部分瀕危藏藥植物離體培養條件

3.4 內生菌

在某些藏藥的組織培養中，內生菌除了起促進種子萌發的作用外，還在植物器官的形成中發揮著重要作用，如蘭科植物，其種子缺乏胚乳等萌發所需的營養物質，只有在合適的菌種侵染下才有可能萌發[52]。GAO Y等[53]在瀕危蘭科藏藥手掌參的根系中分離出了角擔菌屬菌株，將其與手掌參種子共同培養發現，23 d后種子突破種皮形成原球莖，而沒有角擔菌參與共培養的手掌參種子始終未萌發，其原因在于手掌參種子通過消化角擔菌的菌絲獲得營養以供萌發生長。天麻也為珍貴的蘭科藥用植物，其種子的萌發亦需要菌株參與。1980年，研究人員首次分離出有助于天麻種子萌發的菌株“京陜807-02號”，接著又連續分出對天麻萌發有影響的12種擔子菌小菇屬真菌菌株[54]，這為西藏天麻的人工快速繁育提供了一定理論依據。童文君[55]從野生美花石斛根、莖、葉分離得到14株生真菌與67株內生細菌，發現這些菌株具有解無機磷和解有機磷、解鉀及產生長素的能力；將一株兼具三種促生長特性的芽孢桿菌DLB20作用于不同株高美花石斛組培苗中發現，當接種濃度為106 cfu/mL時更有利于組培苗的生根，這表明此菌株有一定的促進美花石斛組培苗生長的潛力。因此，內生菌也成為一些藏藥組織培養的重要影響因素。

4 藏藥組織培養存在的問題

4.1 外植體較難獲取

西藏地域遼闊，氣候復雜，造就了豐富的藏藥資源物種，但其生態環境易受破壞且不易恢復，因而藏藥資源更加珍稀[5]，同時也加大了采藥難度，如冬蟲夏草等瀕危物種采挖極其困難，且只有在國家規劃許可條件下方可進行采收；手掌參繁殖方式主要為無性繁殖，繁殖系數極低，自然更新緩慢，野生資源易遭到破壞，加之從可采收至枯萎的時間僅幾個月，采集可進行組織培養的外植體則極為困難[56]。

4.2 褐化

褐化指在組織培養的過程中，酚類物質氧化成褐色的醌類物質，形成的醌類物質抑制酶活性，愈傷組織形成受阻，進一步使外植體褐化死亡[57]。植物的褐化與自身的基因型、外植體的生理狀態、培養基的種類等息息相關[58-59]。楊爽等[60]以瀕危藏藥手掌參芽部為試驗材料，探究了消毒時間、活性炭濃度、Vc(維生素C)使用方法、暗培養時間等因素對手掌參外植體褐化的影響，結果發現，75%酒精消毒20 s，0.1%氯化汞消毒10 min，Ac(活性炭)1.0 g/L，Vc 2.0 mg/L，先暗培養5～10 d，每3 d轉瓶一次，2 000 Lx光照下培養時，手掌參的褐化程度最低。袁麗紅等[61]以藏紅花的球莖、無菌芽和幼葉為外植體進行組織培養研究發現，球莖的褐化率最低，且連續轉瓶可降低褐化程度。葉耀輝等[50]在桃兒七的組織培養中發現，通過添加活性炭、聚乙烯吡咯烷酮和Vc均可減少褐化，在早期添加 Ac1 g/L，后期添加 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)1 g/L 的組合培養下，褐化程度最低。

4.3 污染

外植體的污染常與外植體自身攜帶的病原菌，以及實驗人員不規范的操作有關[62]。常見污染為細菌污染、真菌污染、病毒污染[63]及植物自身所帶的內生菌污染。細菌污染可通過添加慶大霉素、先鋒霉素、氯霉素等殺菌劑抑制細菌生長。真菌污染可在外植體消毒處理時選擇合適的消毒劑，如漂白粉、氯化汞、過氧化氫、次氯酸納等加以解決。在使用真菌和細菌抑菌劑時均需考慮是否對外植體的生長產生影響，劉蘭等[30]在對瀕危藏藥喜馬拉雅紫茉莉的組織培養中發現，在培養基中添加50 mg/L多菌靈可抑制真菌生長，添加25 mg/L青霉素可抑制細菌生長，且這些濃度下的抑菌劑對外植體的生長無不良影響。植物的內生菌可存在于植株的所有部位，其在植物的生長過程中具有增強宿主抗逆性和抗病害等作用[64]。在某些植物的組織培養過程中，內生菌的存在使外植體常出現增殖率低、生長緩慢、玻璃化嚴重等問題[65]，而手掌參、天麻、桃兒七等多種藏藥的生長又依賴內生菌，如何合理解決內生菌的污染與生長依賴問題，對于此類藏藥的組織培養成功與否至關重要。

4.4 煉苗馴化困難

在植物組織培養過程中，煉苗決定著植株是否能適應人工氣候箱外的自然環境。徐元江等[40]對藏藥匙葉翼首草芽與根莖進行了組織培養和快繁方面的研究，選取生長健壯的苗株，打開瓶口煉苗3 d，取出無菌苗洗凈根部培養基，分別種植于3種栽培基質(蛭石：珍珠巖；蛭石：腐殖土：珍珠巖；蛭石：菜園土：珍珠巖)，研究發現翼首草再生苗煉苗與移栽過程可通過控制水分，添加抗菌劑如多菌靈等方法增加存活概率。在藏藥的組織培養中，應注意藏藥的生活習性特點，盡量使藏藥的組培苗培養生長環境與自然環境接近，以適應西藏特殊的氣候環境[66]。

5 結論與展望

綜上，目前藏藥植物組織培養技術的應用可在短期內獲得大量無菌植株，可一定程度解決藏藥資源量瓶頸問題，并可能定向獲得較大量的目標活性成分[67]。藏藥取得外植體后需要進行合適的消毒處理，既需考慮徹底滅菌，也應兼顧對外植體存活率及生長狀態的影響。藏藥組織培養中常用MS培養基誘導愈傷組織、叢芽增殖等，以1/2 MS誘導植株生根。常用的激素有 6-BA，NAA，KT，IBA等。不同藏藥培養的光照條件、溫度及pH也不盡相同，需根據不同植物加以調整。在藏藥的組織培養中還存在取材較困難、褐化及污染等問題。內生菌的存在影響藏藥材在組織培養中的繁殖率，存活率同時又是部分藏藥種子萌發的必要條件，需權衡解決。多種藏藥已建立起完整的離體培養體系，植物組織培養技術在藏藥保護中的應用日益成熟，但藏藥組培苗如何煉苗馴化，以更好地適應人工氣候箱外的環境，應是重點考慮的問題之一，此外組織培養與野生藏藥活性成分的差別也值得關注。隨著組織培養技術的不斷發展，必定可以有效緩解當下藏藥資源稀缺的問題，推動藏藥向著可持續、產業化、規模化方向發展。