不同炮制品組方的補陽還五湯抗腦缺血損傷及耐缺氧與抗疲勞作用比較研究

李衛(wèi)先，劉園園，李 達

(湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012)

缺血性腦血管疾病是當前導(dǎo)致人類死亡和殘障的主要原因之一，補陽還五湯是臨床防治缺血性腦血管疾病引起的中風及中風后遺癥的常用有效方劑，出自清代醫(yī)學(xué)家王清任的《醫(yī)林改錯》，全方由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等7味中藥組成，在擴張血管、增加腦血流量、降低血液黏滯性、抑制血小板聚集、抗腦栓血、抗衰老及調(diào)節(jié)免疫功能等方面都有廣泛作用[1]，由于中藥必須經(jīng)過炮制以后才能用于臨床而發(fā)揮應(yīng)有效用，而原方中黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎除了有生品外，還有蜜炙和酒炙等炮制品，但原方并未闡明方中各藥所用的具體炮制品，而炮制品的選擇是提高復(fù)方療效的關(guān)鍵問題。為探討本方中各藥的最佳炮制品組合，本文對由黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎等藥不同炮制品組方的補陽還五湯的抗腦缺血和耐缺氧和抗疲勞作用進行比較研究，以確定本方臨床用于抗腦缺血損傷時，方中各藥運用的具體炮制品，為指導(dǎo)中醫(yī)辨證施治，臨床合理用藥，提高方劑療效，發(fā)揮中醫(yī)個性化治療疾病的優(yōu)勢提供參考。

1 材料及儀器

1.1 實驗藥物

實驗所用藥材黃芪、當歸、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等均由湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬一醫(yī)院提供，按《中華人民共和國藥典》(2020版一部)鑒定為合格藥材。腦心通膠囊由陜西步長制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2 試劑

cAMP與β-EP放免藥盒購自解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心。

1.3 實驗動物

清潔級昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；成年清潔級(SD)大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量220～240 g，由湖南斯萊科景達實驗動物有限公司提供，實驗動物許可證號SKY(湘)2013-0005，25 ℃室溫飼養(yǎng)。

1.4 儀器

上海光電醫(yī)用電子儀器有限公司，TGL-16H型高速離心機；上海核福光電儀器有限公司，SN-682型放射免疫計數(shù)器。

2 方法

2.1 樣品分組及提取

2.1.1 樣品分組 補陽還五湯按《方劑學(xué)》教材規(guī)定的劑量稱取。1組：各組成成分均為生品的補陽還五湯水煎液，由黃芪120 g、當歸尾6 g、赤芍4.5 g、地龍3 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g等藥物生品組方的補陽還五湯；2組：黃芪蜜炙，當歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯湯；3組：黃芪蜜炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯；4組：當歸、赤芍、川芎、地龍均酒炙，其他藥物均為生品組方的補陽還五湯。各藥用量同1組。

2.1.2 樣品提取 以上各組藥按量稱取各藥后，加蒸餾水2 000 mL，常溫(25 ℃)浸泡30 min，煮沸后文火煎30 min過濾藥液，加1 000 mL蒸餾水于藥渣中再煎煮25 min，合并兩次濾液，濃縮至補陽還五湯約2.0 g/mL，放入4 ℃冰箱備用。

2.1.3 陽性對照藥制備 將腦心通膠囊去囊，取出內(nèi)容物并加入蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.4 g/kg的混懸液，備用。

2.2 補陽還五湯抗腦缺血、耐缺氧、抗疲勞實驗

2.2.1 分組與給藥 將小鼠分為6組，雌雄各半，每組65只，即空白對照組，腦心通組，不同炮制品組方的補陽還五湯1、2、3、4組。適應(yīng)性飼養(yǎng)各組小鼠1周后，參照動物與人體等效換算標準換算[2]，給予相應(yīng)的藥物補陽還五湯組按13 g/(kg·d)量灌胃，腦心通膠囊組(0.4 g/kg)水溶液灌胃，空白對照組、給予等量生理鹽水，每天2次，連續(xù)2周。

2.2.2 小鼠斷頭后張口喘氣模型[3]各組隨機選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃相應(yīng)的藥物或生理鹽水，各組小鼠末次給藥30 min后于小鼠耳后2 mm處斷頭，造成腦部急性缺血缺氧，記錄各小鼠斷頭后張口喘氣動作的持續(xù)時間(s)。在觀察喘氣時間時，為避免主觀因素影響，采用單盲法，即記錄時間者不知動物給藥情況。

2.2.3 夾閉氣管致小鼠缺血缺氧模型[4]各組隨機選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃相應(yīng)的藥物或生理鹽水，各組小鼠于末次給藥2h后腹腔注射水合氯醛(300 mg/kg)麻醉，固定，頸部正中切口，分離氣管，連接心電監(jiān)護儀監(jiān)測心電圖(ECG)，然后夾閉氣管，立即記錄小鼠心電圖持續(xù)時間，以心電圖消失為心臟停搏指標。

2.2.4 抗耐缺氧實驗[5]各組隨機選取小鼠15只雌雄各半。每天2次，連續(xù)2周，各組分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)的藥物，實驗前各組小鼠禁食，末次給藥后30 min，將小鼠放入裝有20 g鈉石灰的250 mL廣口瓶中，觀察小鼠從進入到死亡的時間。

2.2.5 游泳試驗 各組隨機選取小鼠20只，雌雄各半，作好標記。連續(xù)2周每天2次各組分別灌胃生理鹽水或相應(yīng)的藥物，第14天實驗組和對照組小鼠均放入同一24 ℃恒溫水浴中游泳，觀察記錄小鼠被淹死時間。

2.3 腦缺血再灌注動物模型制備[6]

給藥2周后大鼠不禁水禁食12 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(0.3 mL/100 g)，頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈(CCA)、左頸內(nèi)動脈(ICA)和左頸外動脈(ECA)，用微血管夾將頸總動脈在近分叉處夾閉，將直徑0.2 mm涂有硅酮的尼龍線從頸外動脈插入至頸內(nèi)動脈遠端，阻斷大腦中動脈血流，然后將微血管夾取掉，將頸外動脈結(jié)扎，使大鼠腦缺血，(判斷遠端結(jié)扎無血流的方法：大鼠臉呈蒼白色，瞳孔放大，翻正反射消失，說明產(chǎn)生前腦缺血)，留約1 cm的線頭于外側(cè)，于缺血2h時輕提尼龍線，使其球端回至頸外動脈內(nèi)，即可恢復(fù)大腦中動脈(MCA)血供。假手術(shù)組ICA不插線栓，僅分離血管。以上過程均在室溫恒定(24～25 ℃)情況下進行，以利于評價腦缺血情況。動物清醒后出現(xiàn)對側(cè)前肢腕曲、肘曲、Horner綜合征、肩內(nèi)收、爬行時向?qū)?cè)傾斜為成功模型。

2.4 分組與給藥

將大鼠隨機分成假手術(shù)組，模型組，腦心通組，不同炮制品組方的補陽還五湯1、2、3、4組等7組，每組30只，各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照動物與人體等效換算標準換算[2]，給予相應(yīng)的藥物補陽還五湯組按13 g/(kg·d)量灌胃，腦心通膠囊組(0.4 g/kg)水溶液灌胃，空白對照組、模型組與假手術(shù)組均給予等量生理鹽水，均于造模手術(shù)前14日開始給藥，持續(xù)至造模后第3天，每天2次。

2.5 觀察指標

2.5.1 血漿cAMP(環(huán)磷酸鳥苷)與β-EP(β-內(nèi)啡肽)的測定 各組選取造模成功的大鼠10只摘眼球取血1.5 mL，預(yù)置于50 μLEDTA·2Na抗凝劑的試管內(nèi)，搖勻后置冰浴中，1 h內(nèi)離心(3 000 r/min，10 min)。取上清液0.1 mL移入試管，加入無水酒精2 mL，振搖1 min，靜置5 min后離心(3 000r/min，10 min)，取上清液移入洗凈、烘干的青霉素小瓶內(nèi)，剩余殘渣加75%酒精1 mL，振搖均勻以打碎塊狀物后再離心(3 000 r/min，10 min)，合并上清液于青霉素小瓶內(nèi)，烘干后置于4 ℃保存待測cAMP；另取1.5 mL血加入預(yù)置有30 μL抑肽酶，30 μL EDTA.2Na抗凝劑的試管內(nèi)，迅速低溫離心(4 000 r/min，10 min)取上清液，移入EP管，20 ℃保存待測β-EP。采用放射免疫計數(shù)器檢測，全部程序按藥盒說明書進行。

2.5.2 血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)、血小板因子-4(PF4)、血漿纖維蛋白原以及血液中白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)、血小板總數(shù)的含量測定 各組選取造模成功的大鼠10只，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后分離血清及血漿，用競爭性抑制法酶聯(lián)免疫吸附實驗技術(shù)測定血漿中β-血栓球蛋白(β-TG)、血小板因子-4 (PF4)、血漿纖維蛋白原的含量。另從各組選取造模成功的大鼠10只，從腹主動脈取血后，分別加入裝有EDTA-2Na、肝素鈉以及枸櫞酸鈉的抗凝管中搖勻，采用流式細胞術(shù)測定白細胞總數(shù)、中性粒細胞總數(shù)、血小板總數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 補陽還五湯有效部位對小鼠各項實驗持續(xù)時間的影響

對張口喘氣時間的影響。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補陽還五湯2周后，小鼠斷頭后張口喘氣時間均能不同程度延長(P<0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長小鼠斷頭后張口喘氣時間(P<0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

耐缺氧和游泳實驗。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補陽還五湯2周后，小鼠耐缺氧時間及游泳試驗死亡時間均不同程度延長(P<0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長小鼠耐缺氧試驗及游泳試驗死亡時間(P<0.05)。其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

對小鼠夾閉氣管后心電持續(xù)時間的影響。表1結(jié)果顯示：與空白組比較，各組灌胃給予不同炮制品組方的補陽還五湯2周后，均能不同程度延長夾閉氣管后小鼠心電圖持續(xù)時間(P>0.05)，與生品組(1組)比較，不同炮制品組方的補陽還五湯2、3、4、腦心通膠囊組均能顯著延長夾閉氣管后小鼠心電圖持續(xù)時間(P>0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

表1 補陽還五湯有效部位對小鼠各項實驗持續(xù)時間的影響

3.2 補陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血漿β-TG、PF4、cAMP與β-EP的影響

對血漿β-TG、PF4含量的影響。由表2可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿β-TG、PF4含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組均能不同程度降低大鼠血漿β-TG、PF4含量(P<0.05)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強于1組(P<0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

對血漿cAMP與β-EP含量的影響。由表2可見，與假手術(shù)組比較，造模后大鼠血漿cAMP含量顯著降低，β-EP含量顯著增高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，不同炮制品組方的補陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組血漿cAMP含量均不同程度升高(P<0.01)，β-EP含量不同程度降低(P<0.01)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強于1組(P<0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊無顯著性差異(P>0.05)。

表2 血漿β-TG、PF4、cAMP與β-EP的測定

3.3 補陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血小板計數(shù)、血漿纖維蛋白原、白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)的影響

對血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量的影響。由表3可知，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量均顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補陽還對白細胞計數(shù)及中性粒細胞計數(shù)的影響。由表3可見，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠白細胞計數(shù)及中性粒細胞計數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，不同炮制品組方的補陽還五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組大鼠白細胞計數(shù)及中性粒細胞計數(shù)均不同程度降低(P<0.05)，且2、3、4、腦心通膠囊組均強于1組(P<0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 補陽還五湯復(fù)方顆粒對腦缺血大鼠血液指標的影響

五湯1、2、3、4、腦心通膠囊組大鼠血小板計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量均不同程度降低(P<0.05)。且2、3、4、腦心通膠囊組均強于1組(P<0.05)，其中以2組效果強于3、4、腦心通膠囊組(P<0.05)，3組與4組、腦心通膠囊差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

腦梗塞在臨床上稱之為缺血性腦卒中，指的是腦部血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致局部的腦組織出現(xiàn)受損現(xiàn)象，使患者出現(xiàn)腦組織缺血、缺氧壞死等現(xiàn)象[7]。中醫(yī)對該類疾病患者采取活血化瘀類藥物進行治療，可取得一定療效，補陽還五湯具有補氣活血通絡(luò)的功效。有研究顯示，藥物經(jīng)酒炙后可增強活血通絡(luò)的作用，蜜炙后可增強補脾益氣的作用[8]。本次研究以小鼠斷頭后喘氣時間、鈉石灰廣口瓶中存活時間、恒溫水浴中游泳被淹死時間、小鼠夾閉氣管后心電持續(xù)時間，以及腦缺血后大鼠cAMP與β-EP、PF4、β-TG、血小板計數(shù)、大鼠白細胞計數(shù)、中性粒細胞計數(shù)及血漿纖維蛋白原含量為觀察指標，探討黃芪蜜炙和當歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補陽還五湯抗腦缺血損傷及耐缺氧和抗疲勞作用。本實驗研究結(jié)果表明，小鼠連續(xù)2周灌服不同炮制品組方的補陽還五湯后分別做耐缺氧及抗疲勞游泳實驗，發(fā)現(xiàn)各組小鼠死亡時間與空白組比較均不同程度延長，均能不同程度提高小鼠耐缺氧與生存能力，但由黃芪蜜炙，當歸、赤芍，川芎、地龍等藥酒炙組方的補陽還五湯組作用最強。β-EP是體內(nèi)作用最強的一種內(nèi)源性阿片肽，cAMP則是一種重要的具有生物活性的環(huán)核苷酸?，F(xiàn)代研究表明，缺血缺氧性腦損傷時，會促使神經(jīng)細胞膜去極化而釋放大量的β-EP，其濃度升高可以抑制ATP代謝，使cAMP生成減少，導(dǎo)致血管源性腦水腫，加重腦組織的損害[9]。本研究結(jié)果表明，造模后急性腦梗塞大鼠腦組織中cAMP明顯降低，而β-EP的含量明顯升高，通過不同炮制品組方的補陽還五湯灌胃治療后，發(fā)現(xiàn)各組均能不同程度升高急性腦梗塞大鼠腦組織中cAMP和降低β-EP含量，由黃芪蜜炙，當歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補陽還五湯作用最強，說明此組補陽還五湯對腦缺血大鼠血漿cAMP、β-EP的調(diào)節(jié)作用最強。本研究結(jié)果還顯示，大鼠腦缺血后，與血小板行為密切相關(guān)的血小板α顆粒內(nèi)的特異蛋白質(zhì)β-TG與PE4的含量會發(fā)生明顯變化，且大鼠血小板被大量激活，血液黏性增強，血流速度減慢，導(dǎo)致病灶局部缺血加重，模型組大鼠血漿PF4、β-TG 含量、血小板總數(shù)及血漿纖維蛋白原、白細胞總數(shù)及中性粒細胞計數(shù)顯著高于正常對照組，經(jīng)不同炮制品組方的補陽還五湯灌胃治療后，模型大鼠血清PF4、β-TG、血小板總數(shù)及血漿纖維蛋白原、白細胞總數(shù)及中性粒細胞含量均能不同程度降低，由黃芪蜜炙，當歸、赤芍、川芎、地龍等藥酒炙組方的補陽還五湯作用最強。

綜上所述，補陽還五湯抗腦缺血損傷及耐缺氧與抗疲勞作用時，方中黃芪應(yīng)選用蜜炙品，當歸、赤芍、川芎、地龍等藥物應(yīng)選用酒炙品。