絞股藍皂苷對慢性高眼壓SD大鼠模型中視網膜STAT3和JAK2 mRNA表達的影響

王賢婧，胡 蓉，喻 娟，彭清華*

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007)

青光眼最典型的特征為視神經萎縮和視野缺損，被稱為“全球第二大不可逆致盲眼癥[1]”。從病理學層面看，凡隸屬于青光眼類別的眼疾，其首要病因均源自于視網膜神經節細胞(RGCs)及其軸突不可逆的持續凋亡[2]。高眼壓(IOP)是目前臨床上青光眼最關鍵的診斷要點及治療靶點[3-4]。本研究團隊在實踐中發現，臨床存在某些青光眼患者，即使在眼壓降低到正常水平后，仍存在視神經的損傷[5]。因此，如何保護RGCs，以控制視神經持續性損傷，為青光眼視神經病變防治領域的研究熱點與難點。

絞股藍又稱七葉膽，是葫蘆科絞股藍屬(Gynostemma Blume Bijdr)的多年生草質藤本攀援植物[6]。明代李時珍《本草綱目》中首次記載了絞股藍，其除被譽為“神草”“第二人參”外，“長生不老藥”及“南方人參”亦是其別稱。絞股藍皂苷不僅在調節微循環、清除自由基方面有積極作用，還具備抗炎、抗氧化及預防腫瘤的作用。此外，在提高人體的非特異性免疫力方面[7-9]效果顯著。實驗研究顯示，在缺氧-復氧刺激下由于含氧量減少、缺血損害，從而引起體外海馬切片神經細胞中Ca2+超載、線粒體膜通透性增加及脂質過氧化。而在絞股藍皂苷作用下此現象反而減輕，在脂質過氧化腦損傷過程中絞股藍皂苷有一定的保護作用[10]。

研究發現，在實驗中給雙側頸總動脈結扎(BCCAO)的大鼠日均口服400 mg/kg絞股藍皂苷，結果顯示，在后期氧自由基可顯著被消化，從而使抗氧化功能大幅提高，降低了脂質過氧化物的產生，改善了氧化性DNA的損傷，有效活化抑制了BCCAO大鼠腦胼胝體中的星形膠質細胞，這提示絞股藍皂苷可能改善慢性腦灌注不足引起癡呆等疾病[11]。多項研究表明，絞股藍中的有效成分確實對神經起到保護作用，但目前的研究主要針對腦缺血和缺血再灌注損傷，包括帕金森病、阿爾茨海默病等疾病展開。絞股藍在視神經保護方面的研究未得到足夠的重視，因此本實驗由抑制星形膠質細胞入手，研究絞股藍皂苷對慢性高眼壓SD大鼠模型的視神經保護作用，以期為青光眼視神經病變患者找到更安全有效的藥物治療方法，為進一步探究中醫藥保護視神經提供參考性案例。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康的雄性SD大鼠60只(實驗動物質量合格證：1107272011004989)，2～3月齡，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，體質量180～200 g。本次實驗符合《湖南省實驗動物管理條例》。

1.1.2 藥品與試劑 絞股藍皂苷(陜西冠捷生物科技有限公司，濃度≥98%，編號：No.GY20200323)；mRNA逆轉錄試劑盒(中國北京康為世紀，批號：CW2569)；EDTA(中國大連美倫，批號：MB2514)；UltraSYBR(中國北京康為世紀，批號：CW2601)；核酸染料(中國北京普利萊，批號：PB11141)。

1.1.3 主要儀器 Tono-Pen(American Reichert，型號：AVAI)；熒光定量RCP儀(American Thermo)；熒光PCR板、紫外分光光度計(American Thermo，批號：SPL0960)；電泳儀(中國北京六一儀器廠，批號：DYY2C)、水平瓊脂糖電泳槽(中國北京六一儀器廠，批號：DYCP-31DN)；臺式冷凍離心機(中國湖南湘儀儀器有限公司，批號：H165OR)。

1.2 方法

1.2.1 慢性高眼壓模型建立 參照文獻[12]中的方法，取右眼為手術眼，用燒灼鞏膜淺層靜脈的方法制作慢性高眼壓模型。取健康SD大鼠60只，隨機抽取1/6作為A組：空白組，余下50只大鼠用于建立慢性高眼壓模型。分別于造模前30 min、造模后30 min、造模后7 d和造模后14 d測量右眼眼壓。平均眼壓高于22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的大鼠即為造模成功。若造模后眼壓未上升，或上升后又回落，則進行第二次造模。如果第二次造模也不成功，則將造模失敗的大鼠從研究中排除。

1.2.2 給藥方法 將最終造模成功的50只大鼠均給予噻嗎洛爾滴眼液降眼壓治療，并按隨機數字表法隨機分為5組，每組10只。陰性對照組：生理鹽水灌胃；低劑量組：絞股藍皂苷25 mg/(kg·d)灌胃；中劑量組：絞股藍皂苷50 mg/(kg·d)灌胃；高劑量組：絞股藍皂苷100 mg/(kg·d)灌胃；陽性對照組：維生素B1和維生素B12治療。所有組別每天清晨灌胃，連續灌胃14 d。

1.2.3 取材 對健康SD實驗大鼠連續灌胃14 d，將大鼠處死后立即摘除雙眼眼球；隨后在顯微鏡下分離出大鼠視網膜，將眼前節及玻璃體去除后，使用顯微鏡剝離出大鼠視網膜組織，一部分立即保存于-80 ℃冰箱中，以供qPCR檢測STAT3 mRNA、JAK2 mRNA。

1.2.4 PCR檢測 從組織中使用Trizol(Thermo，美國)提取出總RNA。隨后，以紫外分光光度計測定分離出的RNA質量與數量。用5 μg的總RNA合成cDNA，隨后用于進行定量RT-PCR。應用DDCT方法(2-△△Ct)計算模型組與治療組之間的相對差異。正向和反向引物如下：R-actin：F：ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC；R：TACT-CCTGCTTGCTGATCCAC；產物長度223 bp；R-STAT3：F：ATGTCCTCTATCAGCACAACC；R：GACTCTTCCCACAGGCATCGG；產物長度112 bp；R-JAK2：F：TACTTCCTGACCTTTGCCGTTG；R：AGGTTTGATTTATCTTTCGGCTT；產物長度224 bp。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 眼壓

造模前，各組的眼壓不具有統計學意義。造模后30 min，陰性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組的眼壓較造模前顯著升高，提示造模成功。造模后1周和2周，陰性對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組的眼壓均高于空白組。見表1。

表1 造膜前后各組眼壓對比

2.2 慢性高眼壓大鼠模型中視網膜STAT3 mRNA、JAK2 mRNA相對表達量的變化情況

慢性高眼壓大鼠模型造模成功后，連續灌胃兩周，PCR結果顯示，與陰性對照組相比，低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組STAT3 mRNA、JAK2 mRNA相對表達量均明顯降低，且差異有統計學意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，高劑量組下降最為顯著(P<0.05)；其次為中劑量組(P<0.05)，低劑量組無明顯差異(P>0.05)；進行各治療組組間比較發現中、高劑量組間存在顯著差異(P<0.05)。以上結果說明絞股藍皂苷可抑制STAT3 mRNA、JAK2 mRNA的表達，且高劑量絞股藍的抑制效果最明顯，見表2。擴增曲線見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 STAT3 mRNA擴增曲線

圖2 JAK2 mRNA擴增曲線

圖3 STAT3 mRNA溶解曲線

圖4 JAK2 mRNA溶解曲線

表2 STAT3 mRNA、JAK2 mRNA的相對表達量

3 討論

青光眼本質上是一種中樞神經系統神經元的退行性疾病，與AD/PD/MS有一些相似的神經生物學特征，但該病的發病機制主要是高眼壓導致RGCs軸突原發性損害，并繼發神經免疫炎癥，進而導致視神經損傷[13]。各種免疫細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、米勒細胞、毛細血管和血-視網膜屏障將RGCs層層包圍，以上任一成分發生了病理改變后均可導致RGCs及其軸突的不可逆損傷，進而導致臨床上青光眼的發生與發展[14-16]。

STAT3/JAK2在視網膜星形膠質細胞中表達，是星形膠質細胞激活過程中主要的細胞內信號通路[17]。研究發現，外表呈星形的膠質細胞在急性高血壓眼損傷后早期開始激活，其細胞形態和細胞間結構發生明顯變化，細胞內STAT3/JAK2信號通路在損傷后早期即在膠質細胞中被激活，膠質細胞激活后視網膜神經節細胞則表現出更明顯的損傷[18]。視神經損傷后，RGCs生存的微環境會發生改變，誘發RGCs的繼發性凋亡，從而引起不可逆的視力喪失[19]。本研究發現，絞股藍皂苷可抑制視網膜中STAT3 mRNA和JAK2 mRNA的擴增，從而抑制神經免疫性炎癥反應，進而闡明了絞股藍皂苷對RGCs的保護作用及其作用機制。

在治療消化系統和心血管系統領域的多種疾病上，絞股藍效果較好，不僅安全且性價比也極高。絞股藍的多功能藥用價值主要源于其成分中的一種植物化合物——絞股藍皂苷，屬達瑪烷型四環三萜類，其活性與人參皂苷近似。研究表明，絞股藍皂苷具有抗炎、抗氧化、抗衰老、降脂、調節免疫等作用[7-8，20-22]。目前的研究主要針對腦缺血和缺血再灌注損傷，包括帕金森病、阿爾茨海默病等疾病展開[10-11]。而絞股藍在保護視神經方面的作用卻鮮有關注，因而需要深入探究。利用構造的慢性高眼壓大鼠模型，研究絞股藍皂苷對視神經產生的保護作用，尋找治療多發性硬化這類脫髓鞘疾病的有效技術方案，對臨床視神經保護意義重大。

本研究證明，絞股藍皂苷可抑制視網膜中STAT3和JAK2的mRNA擴增，從而抑制星形膠質細胞的激活，抑制RGCs的凋亡進而保護視神經，且絞股藍高劑量組抑制效果最佳。本研究結果有望為臨床上的青光眼視神經病變患者找到更安全有效的藥物治療方法，并為中醫藥保護視神經的深入研究提供有益參考。絞股藍皂苷保護視神經的具體作用機理及作用機制將是進一步研究的方向。