醋乳香揮發(fā)油GC指紋圖譜研究

段雨晴，黃 菊，孫婉瑾，陳樹(shù)和*，謝四芳，唐佩莉，段雪云

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)院/湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院/湖北省中醫(yī)藥研究院，湖北 武漢 430061)

乳香為橄欖科植物乳香樹(shù)BoswelliacarteriiBirdw.及同屬植物Boswelliabhaw-dajianaBirdw.樹(shù)皮滲出的樹(shù)脂，始載于《明醫(yī)別錄》，性溫，味苦、辛，歸肝、脾、心經(jīng)。乳香有活血行氣止痛、消腫生肌之效，主治胸痹心痛、胃脘疼痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻等癥[1-2]。乳香含3%～8%的揮發(fā)油，其化學(xué)成分是以烯、醇和酮形式存在的多種單萜、倍半萜及二萜[3]，現(xiàn)代藥理研究表明，乳香揮發(fā)油有一定鎮(zhèn)靜、抗炎[4]、抗菌[5]等藥理作用，但其對(duì)黏膜有很強(qiáng)的刺激性，會(huì)引發(fā)嘔吐等不良癥狀，故臨床多用炮制除去部分揮發(fā)油以達(dá)到減毒增效的作用[6]。2020版《中國(guó)藥典》收載乳香的炮制方法為醋炙法，其醋炒的目的是增強(qiáng)活血止痛、收斂生肌的功效，并可矯臭矯味[7]，但現(xiàn)行規(guī)定中醋乳香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還不完善，不同產(chǎn)地和不同加工方式處理的醋乳香飲片質(zhì)量存在一定的差異。中藥指紋圖譜技術(shù)能全面反映中藥材及其飲片的內(nèi)在化學(xué)特征，適用于評(píng)價(jià)不同產(chǎn)區(qū)藥材中各化學(xué)組分的差異[8]，可作為中藥質(zhì)量控制的手段之一。目前乳香指紋圖譜的研究主要集中在以生品和醋炙品中非揮發(fā)性成分建立HPLC指紋圖譜[7-9]，而對(duì)醋乳香揮發(fā)性成分的氣相色譜指紋圖譜的研究還處于空白階段，故本研究采用水蒸氣蒸餾法提取10批醋乳香中的揮發(fā)油，建立醋乳香揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜，旨在為醋乳香飲片質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 飲片樣品 本實(shí)驗(yàn)用的10批醋乳香飲片經(jīng)湖北省中醫(yī)院陳樹(shù)和主任藥師鑒定為正品，樣品批號(hào)和產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。

表1 10批醋乳香飲片產(chǎn)地及來(lái)源信息

1.1.2 試藥 乙酸辛酯對(duì)照品(批號(hào)：111671-201704，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；1-辛醇對(duì)照品(批號(hào)：B24577，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；月桂酸對(duì)照品(批號(hào)：111774-201602，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；檸檬烯對(duì)照品(批號(hào)：100470-201503，純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司)；無(wú)水硫酸鈉、無(wú)水乙醇、甲醇(均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

PerKElmer Clarus 580氣相色譜儀 (美國(guó) PerKElmer公司)；PE-WAX ETR毛細(xì)管柱(0.25 μm× 0.25 mm，30 m)；SPH-300 氮?dú)獍l(fā)生器(北京中惠普分析技術(shù)研所)；CA-2型靜音無(wú)油空氣泵(武漢科林普豐儀器有限公司)。中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng) (2012A科研類(lèi)，國(guó)家藥典委員會(huì))。

2 方法與結(jié)果

2.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度：200 ℃，檢測(cè)器溫度：280 ℃，檢測(cè)器：FID，H2：45 mL/min，空氣：450 mL/min，分流比：20∶1，柱流量：1 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL。程序升溫：初始溫度50 ℃保持1 min，以25 ℃/min升到180 ℃保持3 min，以10 ℃/min 升到240 ℃保持5 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液制備 取10個(gè)批次醋乳香飲片粗粉(過(guò)二號(hào)篩)50 g，精密稱(chēng)定，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加水約250 mL及沸石數(shù)粒，按照2020版《中國(guó)藥典》四部通則2204 揮發(fā)油測(cè)定法甲法測(cè)定揮發(fā)油含量，結(jié)果見(jiàn)表2。所得的揮發(fā)油用無(wú)水硫酸鈉除去水分后，置于-18 ℃冰箱內(nèi)保存。分別精密移取揮發(fā)油0.2 mL，置于2 mL量瓶中，加入無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

表2 各批次醋乳香揮發(fā)油得率

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取檸檬烯對(duì)照品15.88 mg、乙酸辛酯對(duì)照品24.82 mg、1-辛醇對(duì)照品25.34 mg、月桂酸對(duì)照品11.28 mg，分別置于10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含檸檬烯1.588 mg/mL、乙酸辛酯2.482 mg/mL、1-辛醇2.534 mg/mL、月桂酸1.128 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取單一對(duì)照品儲(chǔ)備液各2.0 mL，置同一10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，得到含檸檬烯317.6 μg/mL、乙酸辛酯496.4 μg/mL、1-辛醇506.8 μg/mL、月桂酸225.6 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以乙酸辛酯為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<1%，相對(duì)峰面積RSD均<5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以乙酸辛酯為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均<3%，相對(duì)峰面積的RSD均<5%，表明所用方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S1號(hào)樣品供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下氣相色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，以乙酸辛酯為參照峰，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD<3%，相對(duì)峰面積的RSD均<5%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 GC指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 樣品的測(cè)定 取10批醋乳香飲片，按 “2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在 “2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄色譜圖。

2.4.2 共有峰的標(biāo)定 將“2.4.1”項(xiàng)下測(cè)定的色譜圖依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A版科研類(lèi))，因S6號(hào)樣品峰面積較大，分離度較好，故以 S6樣品圖譜作為參照譜進(jìn)行全峰匹配，選取“時(shí)間窗”寬度為0.1 min，采用多點(diǎn)矯正法生成醋乳香揮發(fā)油GC共有圖譜和醋乳香揮發(fā)油GC疊加圖 (圖1)。綜合考慮各色譜峰共有狀況、分離情況和色譜峰面積，最后標(biāo)記了20個(gè)色譜峰作為共有峰。計(jì)算各樣品共有峰峰面積的占比，結(jié)果顯示，各批樣品共有峰面積占比均為94%以上，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.3 色譜峰的歸屬 采用對(duì)照品對(duì)各峰進(jìn)行指認(rèn)，在 “2.1”項(xiàng)條件下測(cè)定，記錄GC色譜圖，通過(guò)比較各峰保留時(shí)間，對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，結(jié)果顯示1號(hào)峰為檸檬烯，3號(hào)峰為乙酸辛酯，5號(hào)峰為1-辛醇，13號(hào)峰為月桂酸，見(jiàn)圖1。

2.4.4 相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間的計(jì)算 在各批次樣品氣相色譜圖中，3號(hào)色譜峰(乙酸辛酯)為各樣品所共有，峰信號(hào)強(qiáng)，與相鄰峰分離較好，并且乙酸辛酯為乳香揮發(fā)油的主要特征成分和有效成分，故以3號(hào)色譜峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積，見(jiàn)表3、表4。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均<3%，說(shuō)明各共有峰出峰時(shí)間均較穩(wěn)定，其中成分種類(lèi)相對(duì)穩(wěn)定，但各共有峰相對(duì)峰面積RSD值差異較大，說(shuō)明各批次樣品各成分含量有較大不同。

表3 10批樣品GC圖譜共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表4 10批樣品GC圖譜共有峰的相對(duì)峰面積

2.4.5 相似度分析 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)各批次醋乳香揮發(fā)油氣相圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算，見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，各批醋乳香揮發(fā)油氣相色譜圖譜相似度均高于0.96，表明相似度良好。

表5 10批樣品相似度計(jì)算結(jié)果

2.4.6 聚類(lèi)分析 將10批醋乳香樣品20個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 23.0軟件進(jìn)行聚類(lèi)分析(圖2)。選用組內(nèi)聯(lián)接聚類(lèi)法，以歐式平方距離為度量標(biāo)準(zhǔn)；橫坐標(biāo)值越小，表示樣品越相似。由圖2可知，10批樣品可分為2類(lèi)，產(chǎn)地為蘇丹的醋乳香S9聚為一類(lèi)，其余樣品聚為一類(lèi)。

注：1.檸檬烯；3.乙酸辛酯；5.1-辛醇；13.月桂酸。圖1 各成分色譜圖

圖2 10批樣品的聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

3 討論

在色譜條件優(yōu)化時(shí)，以出峰數(shù)目、分離度、峰形狀為參考指標(biāo)，結(jié)合參考文獻(xiàn)[10-13]嘗試多種不同程序升溫的方式，最終以本研究中程序升溫色譜條件為最優(yōu)。在考察供試品制備所用溶劑時(shí)，在相同的制樣條件下比較正己烷、無(wú)水乙醇作為溶劑時(shí)所測(cè)得氣相色譜圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以無(wú)水乙醇作為溶劑時(shí)，分離出的峰情況較好，故選擇無(wú)水乙醇為溶劑。

在采購(gòu)不同批次樣品時(shí)，發(fā)現(xiàn)9號(hào)來(lái)自蘇丹的醋乳香樣品顏色為灰黑色，較其他炮制品顏色深，所提取揮發(fā)油為黃色，與其他批次醋乳香所提取的揮發(fā)油為淺黃綠色相比，顏色稍有不同，且提取揮發(fā)油后剩余的乳香殘?jiān)|(zhì)地較黏，附著在瓶壁上較難清洗，其乙酸辛酯峰與其他供試品相比，峰面積較小，聚類(lèi)分析圖也證明與其他樣品不同，S9號(hào)樣品揮發(fā)油顏色和色譜峰的差異可能是產(chǎn)地差異或者炮制工藝不同造成。

本研究建立了10批醋乳香揮發(fā)性成分的氣相色譜指紋圖譜，各批飲片的峰數(shù)目和峰面積雖然存在一定差異，但整體特征相似，確定了20個(gè)共有峰，可反映醋乳香整體化學(xué)特征，相似度均>0.96，本研究可為醋乳香飲片質(zhì)量控制提供參考。