天然產物及三氮唑類化合物與溴結構域BDR4的分子對接研究

孔祥薇，馮宇翔，張云紅，戴 康

(中南民族大學 藥學院，湖北 武漢 430074)

賴氨酸殘基的乙酰化被認為在組蛋白的翻譯后修飾中發揮關鍵作用[1]。人類基因組編碼46種蛋白質，包含61個BRD，包括溴結構域和末端外(BET)蛋白質家族[2]。該BET家族包括四個蛋白：BRD2、BRD3、BRD4和BRDT(睪丸特異性表達，它們在調節RNA聚合酶II(Pol II)的轉錄方面發揮著不同的作用[3])。所有四種BET蛋白的共同點是兩個保守的N端溴結構域(BD1和BD2)，它們是染色質相互作用模塊，可識別組蛋白尾部和其他核蛋白上的乙酰化賴氨酸殘基[4]。因此，BET蛋白是正常細胞和轉化細胞中表觀遺傳信息的關鍵“閱讀器”。

BET家族中研究最多的是BRD4，與其他BET蛋白的染色質結合特性一致，BRD4優先結合乙酰化組蛋白H3和H4，不同的是BRD4與染色質的結合在整個細胞周期中保持不變[5-6]。蛋白質組學分析表明BRD4與PTEFb相關，PTEFb是一種已知的RNA轉錄調節劑，能夠通過磷酸化 RNA聚合酶II延伸復合物來激活暫停的RNA聚合酶II[7]。BRD4阻止 PTEFb與7SK/HEXIM相關聯，從而使PTEFb保持其活性形式，從而實現RNA聚合酶II延伸和基因轉錄。因此，BRD4作為乙酰化組蛋白和基因轉錄之間的紐帶。

BET蛋白被證實是競爭性抑制劑取代染色質中的溴結構域以影響基因表達變化的有希望的治療靶點。因此，開發用于癌癥治療的新型BET抑制劑代表了尋找抗癌癥藥物的一種新思路。

1 實驗部分

1.1 研究工具和材料

本研究采用Tripos的SYBYL-X2.1.1軟件進行分子對接。使用ChemBioDraw繪制小分子結構，并用 ChemBio3D轉換小分子的結構格式。7MLQ的蛋白質結構來自PBD數據庫 (https：//www1.rcsb.org/structure/7MLQ)。

1.2 小分子配體文件準備

在PubChem Compound數據庫中查找和三氮唑有一定結構相似性的藥物如花青素(Anthocyanin)、苦參堿(Matrine)、喜樹堿(Camptothecin)和紫杉醇(Taxol)結構。根據文獻將26個4-甲基-1，2，3-三氮唑小分子配體文件通過Chemoffice軟件畫出2D結構圖[8]，再用ChemoBio 3D軟件將2D結構轉換為3D結構保存下來留作備用。文件格式轉換為mol2。最后利用SYBYL軟件對小分子配體文件化合物進行優化：①給小分子配體文件加電荷；②對小分子配體文件進行能量優化。接著把所有小分子配體文件保存成配體文件數據庫備用。

1.3 受體文件準備

在PDB數據庫下載編號為7MLQ的含溴結構域蛋白 4(BDR4)受體文件，再在SYBYL軟件中處理受體文件：①先刪除受體文件中的水分子；②分析大分子結構；③對受體文件添加氫；④對受體文件添加電荷；⑤提取復合物晶體中的配體小分子。

1.4 分子對接

通過SYBYL軟件，將已經處理好的配體文件化合物分子作為配體和7MLQ晶體結構進行分子對接運算。對接設置包括分別以sfxc和Mol2文件格式上傳準備好的蛋白質和配體。對接研究使用默認參數運行。

2 結果與討論

受體與配體活性位點之間的結合親和力的穩定性用打分函數判定，即分數越高，配體和受體結合也就越穩定。四個天然產物的結構和分子對接打分函數見表1，26個化合物的結構和分子對接打分函數分別見圖1和表2。同時也用BET抑制劑iBET-151作為對照，其結構見圖2，對接打分函數為6.495 1。結果表明四個天然化學產物中結果都大于6.4，其中花青素得分最高為7.451 4，紫杉醇得分最低為6.440 3。另外在26個化合物中有16個化合物的打分結果大于7，有20個化合物的打分函數高于對照分子，其中化合物8的打分結果最高為8.704 0。

圖1 4-甲基-1，2，3-三唑母核結構

圖2 抑制劑iBET-151結構

表1 天然產物打分結果

表2 化合結構和對接打分結果

實驗結果說明這些化合物與靶點蛋白BRD4有良好的親和力。該類抑制劑的分子結構主要由4-甲基-1，2，3-三氮唑組成，在1位有一個哌啶環上的取代基，5位有一個吡啶環上的取代基。通過打分函數，發現5位有一個吡啶環上的取代基為芳基取代時最好。

化合8與靶蛋白BDR4的對接結果見圖3和圖4。從復合物的三維模擬圖(見圖3)上可以看出氫鍵主要形成在PRO87、VAL87和CYS136 3個氨基酸殘疾上，說明3個氨基酸殘基在相互作用中起到了關鍵性的影響。在二維圖(見圖3)中可看出，除了3個氨基酸殘基參與形成氫鍵以外，ALA89、TYR98、TYR97和PRO104形成了Pi-Alkyl作用。通過研究其他25個分子的分子對接，也得到了相似的結果(文中未列出)。

圖3 化合物8對接三維模擬圖

圖4 化合物8對接二維模擬圖

3 結論

本文選取了4個天然化學產物和已報道的26個合成三氮唑類BET抑制劑為配體分子，將其與BET的BDR4的三維結構(7MLQ)進行了分子對接，并用BET抑制劑iBET-151作為對照。分子對接的結果表明，4個天然化學產物結果都大于6.4，其中花青素得分最高為7.451 4，紫杉醇得分最低為6.440 3。王華等[9]發現花青素是通過抑制分裂素蛋白致活酶的活性從而發揮抗癌作用。目前關于花青素等天然產物的研究不完整，關于它們抗癌作用機制還不明確，需要進一步研究。

26個化合物中16個化合物的打分結果大于7，20個化合物的打分函數高于對照分子，其中化合物8的打分結果最高為8.704 0。三氮唑類5位吡啶環上取代基為芳基取代時，能與周圍的氨基酸殘基形成穩定的氫鍵和螯合鍵。實驗結果說明，這26個藥物能夠較好地抑制BDR4的活性。

BRD4不僅對基因轉錄的調控至關重要，而且還是基因組穩定性的守護者[10]。由于BET 蛋白的溴結構域在家族成員之間具有約75%的同一性，因此能否實現高選擇性化學探針仍不確定。靶向BRD4相互作用蛋白的小分子可能是一種以提高選擇性的方式治療性干擾轉錄的額外策略。因此，BET抑制劑在治療癌癥方面具有廣泛的應用前景。