酶法制備玉米慢消化淀粉的研究

李若敏， 張煥新， 鄭 義， 盤賽昆， 江 娟

(江蘇海洋大學食品科學與工程學院1，連云港 222005) (江蘇農牧科技職業學院2，泰州 225300)

淀粉經淀粉酶、糊精酶、麥芽糖酶水解后形成可被人體吸收的葡萄糖，葡萄糖通過小腸黏膜進入血液，導致餐后血糖指數(GI)快速升高[1]。Englyst等[2]根據人體消化和釋放葡萄糖的速率，將淀粉分為快消化淀粉(RDS，20 min內消化)，慢消化淀粉(20～120 min內消化)和抗性淀粉(120 min仍未消化)。現代營養學研究表明，碳水化合物參與了生物合成反應以及多種生命現象和生理過程，它與人類肥胖、糖尿病和心、腦血管等疾病具有很大的相關性，基于碳水化合物對人體健康和慢性病的膳食營養干預已成為一個重要的研究前沿[3]。慢消化淀粉(SDS)具有緩慢釋放葡萄糖并能被人體吸收的特性，在人體內產生較平緩的血糖應答，不會對血糖平衡系統造成大的壓力，具有預防代謝性疾病的功能。

淀粉消化率受很多因素影響，如淀粉來源、顆粒大小、直鏈淀粉含量、晶型和相對結晶度、鏈長分布等因素[4]。為了改善天然淀粉易吸收的營養缺陷并擴大其應用范圍，國內外大多數研究通過物理、化學或復合法[5]對淀粉進行改性，制備SDS，而采用酶法[6，7]制備SDS的研究相對較少。分支酶(Branching enzyme，BE，EC2.4.1.18)是一類多功能的淀粉酶，屬于糖苷水解家族GH13或GH57，能催化鏈間支化、鏈內環化和鏈內支化三類反應，其機理是先水解供體淀粉鏈上的某一α-1,4糖苷鍵，產生具有帶還原性端的鏈段，然后將該鏈段轉移至受體糖鏈的葡萄糖單元C6的位置，形成α-1,6分支點，完成支化過程，因此可根據其來源和底物種類的不同，合成具有不同功能特性的改性淀粉[8]。本研究以玉米淀粉為原料，采用α-淀粉酶和Bacillusstearothermophilus來源的BE對其連續處理，不僅實驗條件溫和、成本低廉、產品安全性高、對環境污染少，而且可以獲得高含量的SDS產品，為普通玉米淀粉深加工提供新的途徑[9]。

1 材料與方法

1.1 主要材料試劑

天然玉米淀粉：市售；α-淀粉酶、Bacillusstearothermophilus來源的分支酶(200 U/g)、葡萄糖苷酶(1 200 U/g)、豬胰腺α-淀粉酶(80 U/g)、葡萄糖試劑盒；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無水乙醇等均為分析純。

1.2 主要儀器設備

T6型紫外可見分光光度計，85810R型高速冷凍離心機，Labconoo FreeZone 6L型臺式凍干機。

1.3 方法

1.3.1 制備玉米慢消化淀粉(SDS)

稱取玉米淀粉溶解于磷酸鈉緩沖液(10 mol/L，pH 6.5)中，將其分別配制成質量分數為10、15、20、25、30%的淀粉漿溶液，90 ℃水浴振蕩糊化，冷卻至室溫。添加200 U/g α-淀粉酶(以干淀粉質量計)，50 ℃酶解4 h后沸水浴滅酶。取出后分別至于65、70、75、80、85 ℃保溫，調節 pH 至7.0，分別添加100、200、300、400、500 U/g BE(以干淀粉質量記)，酶解2、4、6、8、12 h，沸水浴滅酶。加入兩倍體積的無水乙醇于4 ℃靜置12 h，冷凍離心(8 000 r/min，25 min)，沉淀復溶，-80 ℃儲藏12 h，冷凍干燥72 h，過100 目篩[10]。

1.3.2 單因素實驗設計

單因素實驗主要研究酶作用時間、酶添加量、酶解溫度和淀粉漿濃度4個因素對產物中SDS含量的影響。基本條件設定為：淀粉漿質量分數20%，α-淀粉酶添加量200 U/g，BE添加量300 U/g，α-淀粉酶酶解溫度50 ℃，BE酶解溫度75 ℃，α-淀粉酶解時間4 h，BE酶解時間6 h，進行醇沉，冷凍干燥，過100目篩。模擬體外消化，測定SDS含量。改變其中一個因素，其他因素保持不變，分別考察各因素對SDS含量的影響，每組處理重復3次。

1.3.3 響應面實驗設計

根據單因素實驗優化的結果，如表1所示，選取對SDS含量有影響的酶作用時間、酶添加量、酶解溫度、淀粉漿質量分數為因素，采用Box-Benhnken中心組合設計實驗，進行4因素3水平分析實驗，確定最佳工藝參數，利用響應面實驗設計進行實驗優化[11]。

表1 Box-Benhnken實驗設計的因素水平

1.3.4 SDS質量濃度測定

配制新鮮酶液：取1.8 mL A液(40 μL葡萄糖苷酶稀釋至2.0 mL)、18 mL B液(4.0 g豬胰腺a-淀粉酶溶于26 mL，4 ℃攪拌溶解，離心取上清液)與1.2 mL去離子水混合均勻。

稱取200 mg樣品溶于15 mL磷酸鹽緩沖液(200 mol/L，pH 5.2)，37 ℃保溫5 min加入5.0 mL新鮮酶液，37 ℃、200 r/min條件下反應，在20 min和120 min時各取出0.5 mL反應液加入4倍體積乙醇滅酶，水解產生的葡萄糖含量通過葡萄糖試劑盒測定[12]。

SDS=(G120-G20)×0.9

式中：G20和G120為淀粉水解20 min和120 min時釋放葡萄糖的含量。

1.3.5 復合酶制備慢消化淀粉相關性能測定1.3.5.1 淀粉顆粒形貌觀察

采用掃描電子顯微鏡進行顆粒形態的表征[13]。

1.3.5.2 鏈段分布測定

將淀粉樣品溶解于NaAc-HAc緩沖液(100 mol/L，pH 4.5)中，配制成0.2 mg/mL乳液，并在沸水浴中充分糊化。40 ℃水浴中平衡溫度，并添加3 μL異淀粉酶酶解24 h。沸水浴滅酶，冷卻離心(8 000 r/min，10 min)，上清液通過0.45 μm注射器濾膜，并利用HPAEC-PAD測定鏈長分布[14]。測試條件：色譜柱為CarboPacPA200；洗脫液A為250 mol/L NaOH溶液，洗脫液B為50 mol/L NaAc溶液和150 mol/L NaOH溶液的混合物(首先用液體A平衡色譜柱，然后使用液體B進行洗脫)；流速0.5mL/min；測試溫度25 ℃。

1.3.5.3 相對結晶度測定

將干燥的淀粉樣品填充到壓片機凹槽中并壓實，以確保壓制的淀粉片無裂紋且厚度輕薄均勻，然后將其放置在X射線衍射儀中以掃描和測量改性淀粉的相對結晶度[15]。測試條件：掃描范圍為5°～35°，掃描速度為2°/min，電壓電流分別為40 kV和40 mA。

1.3.5.4 溶解度和膨脹度測定

準確稱取淀粉樣品加去離子水配制成5%的淀粉漿，在95 ℃下加熱攪拌30 min。冷卻至室溫5 000 r/min離心10 min，沉淀部分即為膨脹淀粉。將上清液分離干燥至恒重，即得水溶性淀粉[16]。根據公式計算淀粉溶解度和膨脹度:

1.3.6 數據統計與分析

所有實驗測定均重復3次。測定結果表示為平均值±標準差(SD)。使用SPSS statistics 23對實驗數據進行方差分析確定差異顯著性。圖表使用Origin 2018和Excel進行繪制。

2 結果與分析

2.1 各因素對SDS含量的影響

酶作用時間對SDS含量的影響差異顯著，對SDS含量影響如圖1所示。經糊化的玉米淀粉含有較多長鏈結構，當酶解時間不足時，長直鏈淀粉在酶作用下并未完全被水解成短鏈，較多的長鏈淀粉分子冷卻回生比較緩慢會直接影響SDS的形成[17]。酶解時間為6 h時，SDS質量分數最高，為36.75%。此時淀粉中葡聚糖長鏈已在反應中被BE完全水解，并通過糖基轉移作用使淀粉分子具有更小的支鏈及更高的支化程度，阻礙支鏈淀粉在貯藏過程中分子重排，進而更好的抑制淀粉回生，促使SDS形成。但當酶解時間過長時，淀粉分子內生成了大量較短的鏈段，分子間劇烈活動使淀粉分子不易結晶，SDS形成受到抑制[18]。因此，合適的酶作用時間對SDS含量有很大的影響。因此，選取酶作用時間4、6、8 h進一步實驗。

不同酶添加量對SDS含量存在一定影響，酶的用量影響淀粉的黏度大小。由圖1可知，隨著酶用量的增加，SDS含量也隨之增加。當分支酶添加量為300 U/g(以干淀粉質量計)時，SDS質量分數最高，達到35.85%。但之后SDS含量隨著酶添加量的增加逐漸降低，推測主要原因可能是因為BE屬于糖基轉移酶，它可以先水解供體淀粉鏈上的某一α-1,4-糖苷鍵，生成具有還原性末端的鏈段，繼而將該鏈段通過轉糖基作用轉移至葡萄糖殘基的第6位碳原子上，從而形成適當數量、含有較高分支短鏈比例的α-1,6-糖苷鍵，完成支化過程，并在冷藏回生過程中利用生成的氫鍵和低結晶度從而提高SDS含量[19,20]。而當酶濃度過高時，淀粉糊黏度過低，導致分子擴散性受到影響，生成無活性的中間產物，不利于淀粉回生后結晶，從而影響SDS的生成。此研究結果與趙凱等[21]利用酶脫支處理制備玉米緩慢消化淀粉中發現較高酶濃度會抑制SDS形成的結論一致。因此，選取分支酶的添加量200、300、400 U/g進一步實驗。

由圖1可知，隨著酶作用溫度的升高，反應體系達到適宜溫度，SDS含量隨著酶促反應速度的加快而逐漸增加。當BE在75 ℃下反應時SDS質量分數達到35.41%。繼溫度再升高，SDS含量有所減少。這可能是因為Bacillusstearothermophilus來源的酶熱穩定性較高，但過高或過低的溫度都會降低酶催化效率，影響酶對淀粉分子的水解作用[22]。當酶作用溫度過高時,大部分酶被破壞,發生不可逆變性，導致酶失活不能水解淀粉分子，影響短鏈和結晶的形成，SDS含量降低[23]。因此，選取酶作用溫度70、75、80 ℃進一步實驗。

圖1 各單因素對SDS含量的影響

淀粉漿質量分數對SDS含量影響如圖1所示。當淀粉漿質量分數為20%時，SDS的質量分數最高，達到34.67%。但隨著底物濃度逐漸增大，SDS含量反而隨之降低，這可能是因為當底物濃度過大時，淀粉糊黏度增加，導致酶不能充分與淀粉分子接觸，使酶的水解轉苷作用不能完全發揮[24]。形成有序短鏈結構減少，促使淀粉冷藏回生時相對結晶度下降，SDS含量隨之減少[25]。因此，選取淀粉漿質量分數15%、20%、25%進一步實驗。但總體而言，淀粉漿質量分數對SDS含量影響不明顯，各個底物濃度條件下，SDS含量差別不大。

2.2 響應面實驗優化設計

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

選取酶作用時間、酶添加量、酶解溫度、淀粉漿濃度4個單因素設計實驗。根據單因素實驗結果，采用Box-Benhnken中心組合實驗，考察各個因素對SDS含量的影響，進行4因素3水平的響應面優化實驗，實驗方案及結果見表2。

表2 響應面優化設計及結果

續表2

通過Design-Expert軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合分析后，預測回歸模型為：

Y=37.42+1.32A+0.62B+0.59C+0.33D+0.072AB-0.24AC-0.22AD-0.16BC-0.027BD-0.15CD-3.03A2-1.44B2-2.49C2-2.29D2

表3表明，模型的F值為1.25(>0.05)、P<0.000 1，結果表明所建立的回歸方程模型極顯著。預測值與真實值之間具有較好的相關性，這進一步表明該模型具有良好的擬合度和較小的實驗誤差。

表3 方差分析

該回歸方程可用于酶法制備慢消化玉米淀粉的過程進行初步分析和預測。二次回歸方程中A、B、C、A2、B2、C2和D2對SDS含量的影響極顯著(P<0.01)，其他差異均無統計學意義(P>0.05)。因此，各測試因子對響應值的影響顯示出二次拋物線關系。此外，在酶作用時間、酶添加量、酶解溫度和淀粉漿濃度這4個關鍵因素中，對SDS含量的影響順序為：酶作用時間(A)> 酶添加量(B)>酶解溫度(C)>淀粉漿濃度(D)。擬合F值的缺失為0.69>0.05，P=0.711 7>0.05，表明未知干擾因素對測試結果的影響很小，模型擬合良好，測試誤差小。該模型可用來顯示每個因素和響應值之間的差異。

2.2.2 響應面分析

通過Design-Expert V8.0.6軟件，對各種因素之間的相互作用進行響應面分析。隨著A(酶作用時間)、B(酶添加量)、C(酶解溫度)、D(淀粉漿濃度)的增加，SDS含量(響應值)均呈現先升高后降低的趨勢。作用時間曲線和BE添加量曲線具有相對陡峭的斜率，因此其對SDS含量具有顯著影響；淀粉漿濃度曲線和作用溫度曲線比較平滑，響應值隨該值變化不大，因此對SDS含量影響很小。同時，這4個因素之間存在一定的相互作用，但交互作用不顯著(P>0.05)；較高的SDS含量都出現在每個因素的中心附近，這表明在這種條件下制備的慢消化玉米淀粉的慢消化率可能最好。

2.2.3 驗證實驗

通過Design-Expert V8.0.6軟件響應面優化實驗，對各工藝參數進行優化分析后，SDS質量分數預測值為37.66%，其對應的因素為酶作用時間為6.5 h，需添加BE用量為320.0 U/g，酶反應溫度為75.5 ℃，淀粉漿質量分數21.0%。在最佳工藝條件下設定最佳工藝參數，并進行3次平行實驗，制備酶修飾的慢消化玉米淀粉，SDS質量分數分別為37.2%、36.9%、37.7%，平均值為(37.28±0.34)%，接近模型的預測值，表明使用Box-Benhnken中心組合獲得的工藝參數和響應面分析準確可靠，具有一定的應用價值。

2.3 慢消化淀粉相關性能分析

2.3.1 顆粒形貌分析

利用掃描電鏡觀察淀粉顆粒大小及改性前后表觀特征，將樣品分別于2 000和5 000倍數下進行拍攝觀察。如圖2所示，天然玉米淀粉顆粒大多呈棱角圓滑的多面體結構，少許呈球形，表面凹凸不平狀，部分有細孔[26]。糊化處理使淀粉內部結構發生變化，結晶區被破壞，已完全失去顆粒形態。如箭頭所指處，酶解后出現分布致密規則的孔洞，深入的通向內部結構，部分還出現空殼現象。

圖2 天然玉米淀粉和酶改性6.5 h玉米淀粉的顆粒形貌

2.3.2 鏈段分布分析

通過HPAEC-PAD對淀粉樣品進行鏈長分布測定。對各峰進行積分處理，鏈段分布結果如圖3所示。根據聚合度(DP)將不同長度的鏈段分為3個部分：A鏈(DP≤10)，B鏈(10

表4 酶改性前后玉米淀粉鏈段分布變化

2.3.3 相對結晶度分析

天然玉米淀粉和酶改性淀粉的XRD衍射圖譜如圖4所示，天然玉米淀粉衍射角度2θ在15°、17.5°、19°和 23°出現了4個強度較高的特征衍射峰，這屬于典型的A型晶體衍射圖譜。經BE酶解6.5 h的淀粉樣品，僅在17.5°和22°處有較強的衍射峰，屬于標準B型晶體結構。X-衍射峰強度取決于淀粉內部雙螺旋結構重排的情況以及分子鏈相互作用，因此酶改性淀粉衍射峰下降可能是因為酶對長鏈的水解轉苷作用，使鏈段連接發生變化[28]。利用Jade 6.5軟件對淀粉相對結晶度進行測定，結果顯示，酶改性淀粉相對結晶度為27.11%，比天然淀粉減少了18.10%，這可能是因為脫支處理使淀粉微晶結構發生變化，長鏈有序結構減少，短支鏈結構增加，從而導致相對結晶度降低[29]。

圖4 酶改性前后玉米淀粉XRD衍射圖

2.3.4 溶解度與膨脹度分析

溶解度和溶脹度反映淀粉和水結合的程度，并且與淀粉的內部結構密切相關[30]。根據表5得出，天然玉米淀粉幾乎不溶于水；經酶改性6.5 h的淀粉，溶解度達到29.12%，比天然玉米淀粉提高了20.50%。這可能是因為這種現象與酶水解后無定形區域的直鏈淀粉浸出有關，糊化破壞了淀粉結晶區域的雙螺旋結構，并經酶修飾暴露了更多的氫鍵，親水基團增加，水合性能增強，從而導致淀粉樣品的溶解度增加。天然玉米淀粉的膨脹度為23.58%，酶改性6.5 h后的膨脹度為12.35%，降低了11.23%。 這歸因于BE可以催化α-1,4-糖苷鍵斷裂，增加分支點比例，使質點間結合能力增強從而降低膨脹速率。

表5 酶改性前后淀粉溶解度和膨脹度的變化

2.3.5 體外消化性能分析

根據淀粉的體內消化速率，可將淀粉分為快消化淀粉、慢消化淀粉、抗性淀粉。以天然玉米淀粉為底物進行酶法修飾，利用體外模擬消化對所得改性淀粉的消化性能進行分析。如表6所示，天然玉米淀粉含有較高的RDS，SDS質量分數僅有23.12%。隨著酶作用時間的增加，RDS含量下降，SDS和RS含量有了顯著提高。酶改性6.5 h，SDS和RS質量分數分別增加了14.01%和5.43%，可能是因為酶改性不僅增加淀粉短鏈數量、縮短鏈長，還增加短簇鏈段的分支度，降低淀粉多尺度結構，增加α-1,6-糖苷鍵比例，從而有助于慢消化性能的提高。

表6 酶改性前后淀粉消化性能的變化

3 結論

根據中心組合設計原理，在單因素實驗的基礎上，設計4因素3水平的響應面優化實驗，并以酶作用時間6.5 h、BE添加量為320 U/g、酶解溫度為75.5 ℃、淀粉漿質量分數21%為條件，得到酶法改性玉米慢消化淀粉的最佳制備工藝條件。在此條件下制備的SDS的質量分數為37.28%，接近預測值37.66%。研究結果表明，SDS含量與淀粉精細結構密切相關。觀察其微觀結構，發現具有較高慢消化速率的淀粉顆粒表面在酶水解6.5 h后均出現致密規則的孔洞，這為酶水解提供了孔道結構。通過觀察其精細結構，發現具有較高SDS含量的改性淀粉短鏈比例較高和相對結晶度較低，這表明酶的轉糖基化可以使淀粉產生具有較高支鏈和短鏈的有序結構，促使消化性能降低，經酶改性后的玉米淀粉具有良好的溶解性和膨脹性。