不同熱處理對藜麥蛋白質營養品質的影響

朱瑩瑩， 安雙雙， 王 雷， 董吉林， 申瑞玲

(鄭州輕工業大學食品與生物工程學院1，鄭州 450000) (河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室2，鄭州 450000) (食品生產與安全河南省協同創新中心3，鄭州 450000)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)是一種原產自南美洲的無麩質假谷物，與常見谷物相比，其富含維生素、礦物質和植物化學素，且蛋白質、中性脂肪和膳食纖維含量較高，而淀粉含量較低[1]。研究表明，不同品種藜麥籽粒中蛋白質占干質量的12%～23%，主要由11S球蛋白(37%)、2S清蛋白(35%)及少量醇溶谷蛋白(0.5%～7%)組成[2]。藜麥蛋白質被認為是一種優質食用蛋白，富含人體必需氨基酸且比例均衡，其賴氨酸(Lys，谷物第一限制性氨基酸)含量是小麥蛋白質的10倍以上[3]，甲硫氨酸(Met，大豆主要限制性氨基酸)含量遠高于大豆分離蛋白，且含有嬰幼兒無法合成的組氨酸(His)。作為一種植物蛋白質，藜麥蛋白質不含膽固醇，長期攝入也不會誘發慢性代謝疾病，比動物蛋白質更有利于人體健康[4]。藜麥蛋白質消化水解產物具有抗氧化[5]、抑制血管緊張素轉化酶(ACE)和抑制癌細胞增殖等活性[6,7]。然而，蛋白質功能特性、消化吸收及生理活性均受到加工處理過程的影響[8]。近年來，隨著市場對藜麥健康食品的需求不斷增加，加工處理對藜麥蛋白質營養品質影響的評價也成為了當前的研究熱點。

熱處理是食品加工中最常見的手段。蒸煮、殺菌、噴霧干燥等不同熱處理方式會改變植物蛋白質二級結構，使α-螺旋含量和無規則卷曲含量上升，而β-折疊含量下降，進而不同程度地影響其消化速率[9]。不同熱處理溫度對植物蛋白質結構帶來的影響也存在差異，Rocha等[10]發現135 ℃下處理蕓豆蛋白質更容易導致二硫鍵的交聯。此外，熱處理過程，糖和氨基酸發生美拉德反應，也會一定程度改變植物蛋白質氨基酸模式，同時影響其消化產物的生理活性。李菊芳等[11]發現微波處理菜籽餅粕蛋白質使其水解產物抗氧化活性明顯提高。莧菜種子蛋白經過擠壓膨化處理后，其消化產物展現更高的抗炎活性[12]。目前關于不同熱處理對藜麥蛋白質營養品質、消化特性以及其消化產物生理活性的影響鮮有報道。本研究比較不同熱處理方式對藜麥蛋白質氨基酸組成和體外消化特性的影響，研究不同熱處理后藜麥蛋白質體外消化水解產物抗氧化活性和調節3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型葡萄糖代謝的影響，以期為藜麥蛋白質的深加工與功能性應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥籽粒：青藜2號，2018年9月自青海省海西州藜麥實驗基地收獲，機械脫殼后真空包裝，在干燥、通風、室溫環境儲藏。胃蛋白酶(≥3 200 U/mg)、胰蛋白酶(≥10 000 BAEE U/mg)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Trolox、DMEM完全培養基、小牛血清、胰島素； NaOH、HCl、乙醇，均為分析純； MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、葡萄糖測定試劑盒。

1.2 儀器與設備

XQ200型多功能高速粉碎機，G70D20CN1P-D2微波爐，TPN26MPS-SSL電蒸箱，TWCL-B恒溫電磁爐，MG38CB-AA烤箱，K9840全自動凱氏定氮儀，FCD-3000電熱恒溫鼓風干燥箱，SX-4-10箱式馬弗爐，S433D氨基酸分析儀，全波長酶標儀，SpectraMax Gemini EM熒光酶標儀，OP-160ⅡCO2培養箱，BH-FD-0.2冷凍干燥機。

1.3 方法

1.3.1 藜麥分離蛋白(QPI)的提取

藜麥除雜，水洗除皂苷，40 ℃下烘干水分至(10±2)%，隨后磨粉并過80目篩，并使用石油醚(10%，m/V)脫脂，在室溫下風干，脫脂藜麥粉分散在水中，料液比1∶12，用2 mol/L NaOH調節pH至9.5，35 ℃下攪拌2 h，離心獲得上清液。用2 mol/L HCl調節pH至4.5，離心得到蛋白質沉淀。將沉淀水洗至中性，冷凍干燥后得到QPI，并于4 ℃下儲存。

1.3.2 QPI的熱處理

參考文獻[13,14]確定QPI的熱處理方案。微波干熱：取20 g QPI調節含水量至20%并平衡12 h 后置于耐熱聚乙烯袋，平攤使厚度約0.2 cm，使用微波爐在560 W條件下微波處理3 min，記作QPI-MW；蒸制：取20 g QPI置于不銹鋼蒸盤，平攤至厚度約0.2 cm，置于電蒸箱，常壓蒸制15 min(自電蒸箱溫度升至100 ℃起開始計時)，記作QPI-SM；煮制：取20 g QPI按1∶40加蒸餾水調成懸濁液，置于恒溫電磁爐100 ℃恒溫煮制15 min，邊煮邊攪拌，記作QPI-BL；烘焙：取20 g QPI調節含水量至10%平衡12 h后置于烤盤，平攤厚度約0.2 cm于烤箱烘焙，溫度160 ℃，5 min，記作QPI-BK。熱處理后樣品均冷卻至室溫后重新于冷凍干燥機冷凍干燥，于4 ℃下儲存待用。

1.3.3 QPI蛋白質含量及近似組分分析

QPI蛋白質純度：GB 5009.5—2016方法，氮轉化系數N=5.85；含水量：GB 5009.3—2016方法；脂肪含量：GB 5009.6—2016方法；灰分含量：GB 5009.4—2016方法；剩余組分為總碳水化合物含量。

1.3.4 氨基酸組成分析

參考GB 5009.124—2016中的方法，使用氨基酸分析儀進行分析。配備Na+型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂色譜柱(型號LCK K06/Na)，進樣體積0.05 mL。氨基酸含量表示為mg/g蛋白。

1.3.5 氨基酸評分(AAS)[15]

AAS=樣品中某種必需氨基酸含量/FAO模式中同種氨基酸含量×100%

(1)

1.3.6 體外消化特性測定

將蛋白懸浮液(100 mg/mL)與含胃蛋白酶(2 000 U/mL消化物)的模擬胃液以1∶1(V/V)比例混合稀釋，調節pH至3.0。水浴搖床中孵育消化(37 ℃)，分別在模擬胃消化0、30、60、90、120 min時取樣測定。將胃消化產物與含有胰酶(100 U胰蛋白酶活性/mL消化物)和豬膽汁提取物(最終混合物中10 mmol/L)的模擬腸液按1∶1的體積比混合，調節pH至7.0，分別在模擬腸消化0、30、60、90、120 min時取樣測定，2 h后得到腸消化產物，并做3次平行實驗。各階段待測試樣經沸水滅酶，離心后得到上清液，通過凱氏定氮法測定上清液中蛋白含量進而計算胃腸消化率[16]。最終胃腸消化產物經離心后冷凍干燥，于4 ℃儲存以備進一步實驗。消化率按照式(2)計算。

PD=(CS-CB)/CSample×100%

(2)

式中：PD為蛋白質消化率/%，CS為上清液中的蛋白質含量/mg/mL，CB為空白樣中蛋白質含量/mg/mL，CSample為樣品中的蛋白質含量/mg/mL。

1.3.7 抗氧化活性測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力

參考文獻[17]報道方法，稍作修改。使用超純水配制蛋白消化水解產物至終質量濃度0.5、1、2、4、6、8 mg/mL，取不同濃度的樣品1 mL分別與3 mL0.02 mol/L的DPPH溶液混合，室溫靜置反應20 min，使用酶標儀測定其在517 nm下吸光度值(A1)。陰性對照組以95%乙醇替代DPPH，按如上步驟測定吸光度值(A0)，空白組以超純水代替樣品，測定吸光度值(A2)，按式(3)計算：

DPPH自由基清除能力=1-(A1-A2)/A0×100%

(3)

1.3.7.2 氧自由基吸收能力(ORAC)

參照文獻[18]，稍作改動。具體如下：黑色96孔板底部分別加入20 μL磷酸緩沖液(空白對照)或待測樣品(0.5、1、2、4、6、8 g/L)，37 ℃下暗處反應10 min，加入200 μL熒光工作液，37 ℃暗處繼續反應20 min，加入20 μL自由基誘發劑(ABAP)，37 ℃下，激發波長485 nm，發射波長 538 nm，使用熒光酶標儀測定其150 min 內熒光強度變化，每5 min測定1次。記錄不同樣品測定熒光熄滅曲線下面積(AUCs)與空白對照孔熒光熄滅曲線下面積(AUCb)，計算兩者差值。以不同濃度Trolox代替樣品測定結果繪制標準曲線，帶入樣品計算樣品ORAC值。結果以每克樣品的Trolox當量表示。

1.3.8 藜麥蛋白消化產物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響

1.3.8.1 MTT法測定體外胃腸消化產物對3T3-L1脂肪細胞增殖的影響

3T3-L1小鼠前體脂肪細胞接種于含10%胎牛血清，1%青霉素和1%硫酸鏈霉素的DMEM高糖培養基中，37 ℃，5% CO2培養箱中培養并傳代，于對數生長期時進行實驗。將3T3-L1脂肪細胞接種于96孔板內，接種密度為1×105/mL，達到約80%融合時，換以含不同質量濃度(0.3、0.6、0.9、1.2、1.5 mg/mL)蛋白消化產物(不添加樣品組為對照)的DMEM培養基孵育48 h，然后每孔加入MTT(5mg/mL)10 μL繼續孵育4 h，移出培養基，每孔加入200 μL二甲基亞砜，采用酶標儀于570 nm處測定吸光度。細胞增殖率按式(4)計算：

細胞增殖率=(樣品組吸光度/對照組吸光度)×100%

(4)

1.3.8.2 3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的構建與鑒定[19]

3T3-L1細胞接種于12孔板中，細胞融合2 d達到接觸抑制后進行誘導分化實驗，用含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L Dex、10 mg/L Ins的培養基培養48 h，換用含5 mg/L Ins的培養基培養48 h，再用DMEM培養基繼續培養，每2 d換液1次，培養6 d，分化為成熟脂肪細胞，待細胞分化完全后，將成熟的3T3-L1脂肪細胞分為正常組和誘導組(分為4組)，正常組給予DMEM培養基，誘導組中含有1 μmol/L的Dex，分別在誘導12、24、36、48 h后用葡萄糖氧化酶試劑盒測定培養基中的葡萄糖含量，按式(5)計算葡萄糖攝取量。

葡萄糖攝取量=空白組葡萄糖含量-誘導組葡萄糖含量

(5)

1.3.8.3 蛋白消化產物對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖攝取量的影響

在最佳誘導時間的基礎上構建3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型，分為模型組和加樣組，模型組給予DMEM培養基，加樣組中含有不同質量濃度(0.625、1.250 mg/mL)的藜麥蛋白消化產物，干預36 h后測定培養基中葡萄糖的含量。

1.3.9 數據統計與分析

所有實驗均重復3次，實驗數據以平均值±標準差(X±SD)表示。采用SPSS 20.0進行顯著性分析(ANOVA，t檢驗，P<0.05)，采用Origin 7.5軟件進行作圖。

2 結果與討論

2.1 熱處理對藜麥QPI中蛋白質及其他組分含量的影響

如表1所示，未處理QPI樣品蛋白質含量為89.8 g/100 g，其余營養組分按含量從高到低依次包括淀粉、水分、灰分和脂肪。本研究提取QPI蛋白質純度高于Abugoch等[20]的77.2%，低于Ruiz等[13]的90%～93%，與何興芬[21]的87.17%結果相近。經過不同方式熱處理后，各組樣品蛋白質含量無顯著性差異(P>0.05)，說明微波、蒸制、煮制和烘焙4種熱處理方式對QPI蛋白質純度無明顯影響。此外，4種熱處理對所提取QPI中淀粉、灰分和脂肪含量的影響也不顯著(P>0.05)。是QPI-SM和QPI-BL組樣品中含水量顯著高于QPI組、QPI-MW組和QPI-BK組(P<0.05)，說明蒸制和煮制處理能夠增加QPI樣品含水量，這與馬藝超[22]對苦蕎的研究結果一致。熱變性蛋白質的結合水能力增加，蒸煮處理不僅導致蛋白質熱變性，同時環境中存在大量蒸汽和水分，使得水分與蛋白質結合，變得不易揮發。

表1 不同熱處理藜麥QPI營養組分分析/g/100 g

2.2 熱處理對藜麥QPI的氨基酸組成影響

氨基酸是蛋白質的基本組成成分，蛋白質主要以氨基酸形式被機體吸收利用，因此藜麥蛋白質營養品質的高低主要取決于必需氨基酸的含量和組成[23]。如表2所示，QPI中氨基酸組成豐富，含有人體必需的8種氨基酸，以及嬰幼兒無法合成的His，與之前報道一致[24]。QPI樣品中Glu含量最高，其次是Asp和Arg，而Met+Cys含量最低，該結果與Abugoch等[20]采用堿溶液提取藜麥蛋白的結果相一致。經過4種不同熱處理后，QPI必需氨基酸含量發生一定變化：蒸制、煮制和烘焙處理后QPI中必需氨基酸(包括His)總量顯著降低(P<0.05)，而微波處理對QPI總必需氨基酸含量無顯著影響(P>0.05)。此外，不同熱處理還改變了QPI氨基酸組成：微波處理主要降低了Trp、Phe+Tyr、Gly和Ala含量，增加了Met+Cys、Arg和Val含量；蒸制處理主要降低了His、Phe+Tyr和Gly含量，增加了Arg、Pro、Val和Met+Cys含量；煮制處理降低了His、Gly、Phe+Tyr、Leu、Pro、Thr、Ala、Ser和Glu含量，增加了Arg、Trp和Val含量；烘焙處理降低了His、Trp、Pro和Gly含量，增加了Arg、Val和Met+Cys含量。可能是QPI樣品含有淀粉雜質，不同熱處理導致了不同程度的美拉德反應，從而改變的氨基酸含量和組成，但是具體原因有待進一步研究。

表2 不同熱加工方式藜麥氨基酸組成/mg/g 蛋白

表3為與FAO推薦人體必需氨基酸模式比較所得QPI中人體必需氨基酸評分，一般認為評分越接近100，說明樣品中氨基酸模式越接近于推薦值，其營養價值越高[25]。對于熱處理前后的QPI樣品，Lys最接近100，Thr、Phe+Tyr、Leu和Ile分值在100附近，說明這幾種氨基酸基本可以滿足推薦要求。QPI中Trp和His評分較高，均大于300，經過不同熱處理后雖然評分有所降低，但仍然都大于200，這表明QPI是這兩種氨基酸膳食補充劑的優質來源。Met+Cys和Val的評分較低，這一定程度的限制了QPI的營養價值，然而值得注意的是，微波處理將Met+Cys的評分從41.63提高至68.53，烘焙處理將Val評分從62.8提高至72.52，這說明這2種熱處理可以改善QPI營養價值。經不同熱處理后QPI各組分氨基酸含量發生變化，大部分必需氨基酸仍可以滿足推薦需求，可作為高品質蛋白成分在食品中添加應用。

2.3 熱處理對藜麥QPI體外消化特性影響

體外模擬蛋白質消化過程可以了解蛋白質在胃、腸內的消化情況，并通過消化率反映出蛋白質被消化、吸收的程度。如圖1所示，隨著消化時間的延長，各組QPI消化率逐漸增加。各組QPI在胃消化前期(0～60 min)及腸消化前期(120～180 min)的消化速率分別高于對應消化階段的后期(60～120 min，180～240 min)，這可能與消化過程中底物濃度的降低有關。微波和煮制處理分別使QPI的最終消化率顯著提升(P<0.05)，而蒸制和烘焙則對蛋白質的消化率產生了不利影響。Huang等[26]和Sun等[27]的研究也發現不同熱處理方式對植物蛋白質消化率的影響存在差異，擠壓膨化和高溫高壓處理能顯著提高蛋白質消化率，而烘焙則對蛋白質消化率無顯著影響，這可能與不同熱處理過程中蛋白質分子結構變化有關。此外，Opazo-Navarrete等[28]發現熱處理溫度不同，蛋白質消化率也有差異。隨著蛋白質熱處理溫度的升高(60～120 ℃)，蛋白質消化水解率下降，這是因為過高的溫度會導致蛋白質變性和聚集，進而會影響酶的可接近性。

圖1 熱處理后QPI的體外胃腸消化率

2.4 熱處理對藜麥QPI消化產物體外抗氧化活性影響

由圖2可知，QPI消化產物具有抗氧化作用，熱處理一定程度影響其抗氧化能力。在測定質量濃度范圍內(0.5～8.0 mg/mL)，不同熱處理 QPI消化產物均展現出DPPH自由基清除能力，且隨著樣品濃度的增加清除能力增強。這是由于經過體外消化后，QPI大部分被水解為多肽或者氨基酸，肽類具有電子供體物質可以阻斷自由基的鏈式反應。微波處理和烘焙處理后，QPI消化產物DPPH自由基清除能力增強。這與李苗云等[29]關于發酵酸肉的報道一致，他們發現，微波和烘焙處理有助于增強發酵酸肉多肽體外清除DPPH自由基能力。這可能是由于加熱使蛋白質高級結構受損，其中疏水基團暴露，更易與DPPH自由基發生結合，從而達到清除目的。蒸制和煮制降低了QPI消化產物DPPH自由基清除能力，可能是由于這兩種熱處理方式更利于其親水基團暴露。在測定質量濃度范圍內(0.5～8.0 mg/mL)，各組樣品氧自由基吸收能力變化與其DPPH自由基清除能力大體一致。

2.5 熱處理藜麥QPI消化產物對3T3-L1脂肪細胞增殖的影響

圖3反映了QPI消化產物對3T3-L1前體脂肪細胞增殖的影響。對照組中，表現出穩定的細胞活力(100%生長率)。在不同樣品的作用下，細胞活力表現出明顯差異。當樣品濃度較低時，熱處理前后QPI消化產物均對細胞的增殖有促進作用，隨著濃度的進一步增加，細胞活力明顯下降，最終表現出細胞毒性。當質量濃度在0.625 mg/mL左右時細胞增殖促進作用最好，當質量濃度在1.25 mg/mL時可基本穩定在正常狀態(±20%)。因此，后續實驗過程中，為了防止細胞活力下降，樣品質量濃度應設置在1.25 mg/mL以下。

圖3 熱處理藜麥QPI消化產物對3T3-L1脂肪細胞增殖的影響

2.6 熱處理QPI消化產物對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型葡萄糖代謝的影響

胰島素抵抗是指由于各種原因使得靶器官組織對葡萄糖的攝取和利用效率降低，是Ⅱ型糖尿病的重要標志。在體內可將葡萄糖的消耗(血糖)量作為表現特征，體外實驗則可將培養基中葡萄糖的含量作為測定指標[30]。圖4顯示了不同誘導時間對3T3-L1脂肪細胞產生胰島素抵抗的影響，隨著誘導時間的逐漸增長，細胞對葡萄糖的攝入量逐漸減少，當誘導時間為36 h時，攝取量可減少40.45%，產生顯著的抵抗效果，因此確定胰島素抵抗細胞模型的誘導時間為36 h。在此基礎上，測定不同質量濃度QPI消化產物(0.625、1.250 mg/mL)對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型葡萄糖攝取量的影響。未處理QPI消化產物能夠一定程度地促進3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型對葡萄糖的攝取，這表明藜麥QPI消化產物具有改善胰島素抵抗從而預防Ⅱ型糖尿病發生的作用。高劑量QPI-SM、QPI-BL和QPI-BK消化產物組細胞對葡萄糖的攝取量顯著高于未處理QPI消化產物組(P<0.05)，這說明不同蒸制、煮制和烘焙處理提高了藜麥QPI消化產物改善胰島素抵抗的作用。目前，已有多項研究發現熱處理能夠提高植物蛋白質消化產物的生理活性，這主要是由于熱處理改變植物蛋白質分子結構及消化特性，從而改變消化產物中多肽的組成，導致其生理活性改變。本研究中熱處理前后藜麥QPI消化產物中的多肽組成差異，有待進一步研究。

3 結論

藜麥QPI中氨基酸含量豐富，熱處理后氨基酸組成雖然發生變化，但大部分必需氨基酸仍可以滿足推薦攝入需求，可作為優質蛋白質來源在食品中添加應用。QPI具有良好的體外消化性，微波處理和煮制處理能進一步提高其終消化率。QPI消化產物具有DPPH自由基清除能力和氧自由基吸收能力，微波和烘焙處理增強其抗氧化能力。此外，QPI消化產物能夠促進3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型對葡萄糖的攝取，從而改善胰島素抵抗，蒸制、煮制和烘焙處理可一定程度提高該效果。今后，熱處理對QPI分子結構影響、QPI消化產物肽的級分與其生物活性關系的相關研究還需進一步開展。