樟樹籽油抗氧化能力及物質基礎研究

李 雪， 張 玉， 王君虹， 孫素玲， 王 偉,朱申龍， 沈國新， 牛二利

(浙江省農業科學院農產品質量安全與營養研究所1，杭州 310021) (農業農村部農產品信息溯源重點實驗2，杭州 310021) (浙江省農業科學院木本油料品質營養國際聯合實驗室3，杭州 310021)

植物油氧化是指其在加工、儲藏過程中與氧氣進行的反應。油脂氧化反應產物—過氧化物分解可形成具有異味的酸敗產物，導致油的感官風味變差；同時，油脂酸敗會破壞油中的營養組分，使油的營養品質降低；而有些氧化產物具有致癌性，食用后會誘發機體的生理異常，危害人體健康[1,2]。因此，油脂氧化是影響植物油質量安全的主要因素。氧化應激普遍存在于生物體內，活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是導致氧化應激的主要因素，ROS是細胞內氧化還原穩態信號調節分子，當其水平超過正常范圍時，體內氧化還原穩態被打破，使靶組織和敏感細胞損傷，進而導致多種疾病的發生、發展[3]。植物油中的天然抗氧化物可保持油脂的感官和營養品質并延長其貨架期，還對保護人體防御氧化應激損傷具有重要作用[4]。因此，抗氧化活性是評價植物油品質的重要指標之一[5]。植物油的抗氧化活性影響因素較多，研究表明脂肪酸組成及微量組分多酚、不皂化物等與植物油的抗氧化能力密切相關[6,7]，其中微量組分的作用受到廣泛關注。

樟樹屬于樟科樟屬，常綠高大喬木植物，廣泛分布于我國長江流域及長江以南地區，資源十分豐富。樟樹單棵樟樹籽年產量可達50 kg以上，但長期以來樟樹籽基本處于“自生自滅”狀態，開發利用極少，造成了資源浪費和環境污染[8]。因此，樟樹籽的開發利用具有極大的現實意義。據報道，樟樹籽含油量達到37%以上，其油脂中含有多種脂肪酸，主要為癸酸和月桂酸，相對質量分數在90%以上[9]。樟樹籽油溶點低、皂化值高，屬于不干性油，無毒副作用，可用作化妝品的乳化劑、均質劑、防凍劑，食品中的乳化劑、穩定劑和潤濕劑等[10]。另外，樟樹籽油還是生產生物柴油的好原料[11]。樟樹籽油不僅可用于工業上，還具有抑菌[12]、快速補充能量[13]、顯著減少體內脂肪蓄積的作用[14]，對肥胖導致的代謝紊亂、菌群失調、動脈硬化等均具有改善作用，其中，抗氧化活性在樟樹籽油改善代謝紊亂的機制中發揮重要作用[15-17]。由此，樟樹籽油在食品及醫藥領域具有廣闊的開發前景。樟樹籽油活性物質基礎的研究相對薄弱，目前研究主要集中在樟樹籽油的脂肪酸組成及加工工藝上[8,9]，對于微量化合物及其對樟樹籽油活性的貢獻率研究較少，這制約了樟樹籽油的進一步開發與利用。因此，本研究以樟樹籽油為實驗對象，對其理化參數、化合物組成(脂肪酸、不皂化物、總多酚)及抗氧化活性進行分析，初步明確抗氧化活性物質基礎，為樟樹籽油的開發利用及提高樟樹資源的利用率提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樟樹籽油、初榨橄欖油。

37種脂肪酸甲酯標樣(純度>99%)，沒食子酸標準品(純度>99%)，苯并[α]芘標準品(純度>99%)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)，福林酚試劑、氫氧化鉀，酚酞、異辛烷、冰醋酸、碘化鉀、硫代硫酸鈉、淀粉、環己烷、正庚烷、無水乙醇、甲醇、碳酸鈉均為分析純。甲苯、乙腈、正己烷、二氯甲烷、乙醚為色譜純。超純水(電阻率18.2 mΩ·cm-1)。苯并[α]芘分子印跡柱(500 mg，6 mL)。

1.2 儀器設備

Trace 3100氣相色譜儀配備氫火焰離子化檢測器，AMR-100全自動酶標分析儀，Waters e2695高效液相色譜儀，RV10-D-V型旋轉蒸發器。

1.3 實驗方法

1.3.1 樟樹籽油理化指標檢測

樟樹籽油過氧化值及酸值的測定分別依照國標方法GB 5009.227—2016及GB 5009.229—2016[18-19]。苯并[α]芘測定參照GB 5009.27—2016[20]。色澤、透明度測定參照GB/T 5525—2008[21]。

1.3.2 脂肪酸組成分析

脂肪酸甲酯化依據國際油橄欖協會(IOC)COI/T.20/Doc. No 33[22]標準方法。

氣相色譜條件：HP-88毛細管柱 (30 m×0.25 mm×0.2 μm i.d., Agilent)。升溫程序：70 ℃保持1 min, 以 10 ℃/min升至120 ℃保持1.5 min，以3 ℃/min升至230 ℃保持2 min，分流進樣，分流比1∶50。進樣量0.5 μL，檢測器及進樣口溫度為270 ℃，載氣為氮氣，流速2 mL/min-1。

1.3.3 總多酚分析

樟樹籽油中總多酚的檢測參照文獻方法[23]，采用液液萃取法進行多酚類化合物的提取，采用福林酚比色法在750 nm波長處測定樣品吸光度，以沒食子酸作為標準溶液制作工作曲線，計算樣品中總多酚含量。

1.3.4 不皂化物分析

樟樹籽油不皂化物的制備參考文獻方法[24]，并稍作修改：準確稱取5 g樟樹籽油，加入50 mL 2 mol/L的氫氧化鉀乙醇溶液，80 ℃水浴回流1 h。停止加熱后于冷凝管頂部加入50 mL蒸餾水，旋轉搖動。冷卻后，回流液轉移至分液漏斗中，加入100 mL乙醚萃取不皂化物，重復萃取1次，合并2次萃取液，并轉移至分液漏斗中。在萃取液中加入40 mL水進行洗滌，收集上層液體，重復洗滌2次，回收上層提取液，低溫減壓蒸干溶劑，殘渣在(103±2) ℃烘箱中干燥15 min。準確稱量殘渣質量，計算不皂化物含量，備用。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定

參照文獻[23]報道的方法，稍加改動：吸取樣品待測液100 μL，加入0.4 mmol/L DPPH溶液100 μL，搖勻，室溫反應30 min，應用全自動酶標儀測定520 nm波長處的吸光度(A樣品)；樣品待測液100 μL與無水乙醇100 μL混合，在520 nm處測定吸光度(A對照)；測定100 μL DPPH溶液與100 μL無水乙醇的混合液在520 nm波長處的吸光度(A空白)。DPPH清除率按以下公式計算：

1.3.6 數據處理

數據采用3次重復實驗的平均值和相對標準偏差(RSD)表示。采用GraphPad prism (ver. 5, GraphPad Software?, USA)進行抗氧化活性的IC50值計算，利用Microsoft Excel 2007軟件進行數據統計及顯著性分析，P<0.05被認為是顯著的，P<0.01被認為是極顯著。

2 結果與分析

2.1 樟樹籽油的理化性質

樟樹籽油的理化參數測定結果見表1。樟樹籽油在常溫下為液態，顏色呈淡黃色，色澤澄清透明，具有樟樹特有的芳香氣味，無異味。油脂酸值為(2.4±0.0)mg/g，顯著高于文獻報道值(0.168～0.178mg/g)[9, 25]，表明游離脂肪酸含量較高，可能是榨油原料的質量問題導致其酸值偏高；油脂過氧化值為(0.16±0.01) mmol/kg，顯著低于文獻中測定數據(1.665 mmol/kg-1)，說明樟樹籽油過氧化物含量少，油脂氧化程度低[15]；以上指標符合國家食用植物油標準(GB 2716—2018)[26]。樟樹籽油苯并[α]芘含量為(6.00±0.21) μg/kg，低于國家食品中污染物限量標準(GB 2762—2017)中油脂及其制品中苯并[α]芘的限量要求[27]。

表1 樟樹籽油的理化性質與微量化合物含量

2.2 樟樹籽油的脂肪酸組成

樟樹籽油的脂肪酸通過與標準物質保留時間比對進行定性分析，按照峰面積歸一化法進行定量，結果見表2。

表2 樟樹籽油脂肪酸組成及含量

從樟樹籽油中共鑒定出14種脂肪酸，包括4種中鏈脂肪酸：辛酸、癸酸、十一碳酸及月桂酸，含量高達94.80%；10種長鏈脂肪酸：主要為豆蔻酸、棕櫚酸、油酸及亞油酸等，質量分數為5.20%，長鏈脂肪酸中還包括少量的ω-3脂肪酸(α-亞麻酸、二十碳五烯酸)及ω-6脂肪酸(亞油酸、γ-亞麻酸)，質量分數分別為0.08%和0.59%。與前人關于樟樹籽油脂肪酸組成的分析結果相比[9, 13, 25]，本研究檢測到十一碳酸、棕櫚油酸、γ-亞麻酸、二十碳烯酸和二十碳五烯酸等5種脂肪酸，不同提取方法對油中脂肪酸組成影響較小，但對其相對含量有較大的影響。據報道，高含量的中鏈脂肪酸與樟樹籽油改善肥胖、調節機體代謝紊亂的作用密切相關[15,16]。亞油酸及亞麻酸等不飽和脂肪酸具有多種生理功能，包括降低心血管疾病發病率和死亡率等[28]。

2.3 樟樹籽油的微量化合物含量分析

樟樹籽油中總多酚含量為(33.07±0.63)mg/kg(表1)，與國內橄欖油中總多酚含量相當(21.26～26.04 mg/kg)[29]。目前，對山茶油和橄欖油等木本油料中多酚類化合物的研究已有較多報道[30-32]，但對樟樹籽油中多酚組分的研究極少。多酚類化合物是植物油中重要的化學組成部分，其數量繁多、結構多樣，與植物油的獨特風味密切相關，作為活性極強的天然抗氧化劑多酚化合物可增強油脂的氧化穩定性、延長油脂的貨架期[33]。此外，研究表明多酚化合物具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、改善心腦血管疾病的作用[33]。鑒于多酚化合物在植物油營養品質保持及功能活性發揮方面具有重要作用，開展樟樹籽油中多酚化合物的研究對于其開發利用具有重要意義。

樟樹籽油中不皂化物為(0.55±0.01)%，遠高于文獻報道的樟樹籽油中不皂化物含量[(0.32±0.04)g/kg][15],油提取方法的不同可能是導致不皂化物含量差異的主要原因。有研究對不同植物油(橄欖油、元寶楓油、美藤果油、亞麻籽油、長柄扁桃油、核桃油)的不皂化物含量進行分析，不同種類油的不皂化物差異不顯著，在0.73%～0.98%之間，樟樹籽油的不皂化物含量略低于其他植物油。不皂化物是植物油微量組分中的重要成分，其主要由脂肪醇、甾醇、三萜烯二醇、生育酚及角鯊烯等化合物組成，功能活性研究表明不皂化物具有抗炎及改善氧化應激的作用，并可通過調節T細胞的活性及腸道歸巢能力促進炎癥性腸病的治療[24, 34]。目前，關于樟樹籽油中不皂化物的活性研究鮮見報道。

2.4 樟樹籽油的抗氧化能力及活性化合物分析

抗氧化活性是評價植物油品質的重要指標之一。DPPH是一種穩定的氮中心自由基，在溶液中顯紫色，抗氧化物質通過單電子轉移降低自由基含量，紫色消失[35]。因其操作簡單、快速，DPPH自由基清除方法被廣泛用于化合物體外抗氧化活性的研究。本實驗采用DPPH自由基清除法對樟樹籽油的抗氧化能力進行測定，并以橄欖油作為對照。結果表明，樟樹籽油濃度為0.39 g/mL時，對DPPH自由基的清除率為(92.69±1.92)%，相同濃度的橄欖油的DPPH清除率為(96.23±0.26)%，樟樹籽籽油對DPPH具有較高的清除率，但其清除能力略低于橄欖油。如圖1所示，樟樹籽油對DPPH的清除率與其濃度呈正相關性,通過清除率擬合曲線，其清除率的IC50值為0.13 g/mL。

圖1 樟樹籽油對DPPH自由基抑制率

針對樟樹籽油抗氧化活性物質不明的問題，本研究分別對樟樹籽油中的多酚組分及不皂化物的DPPH清除率進行測定。結果表明，當相同樟樹籽油濃度作為基準的條件下(0.50 g/mL)，樟樹籽油的DPPH清除率為(98.92±1.58)%，多酚組分的DPPH清除率為(49.60±3.78)%，不皂化物對DPPH清除率為(38.49±0.66)%，多酚類化合物的DPPH清除活性顯著高于不皂化物，多酚化合物和不皂化物對樟樹籽油DPPH清除能力的貢獻率分別為50.14%和38.90%，二者的貢獻率之和為89.04%，由此可見，樟樹籽油清除DPPH自由基的活性組分主要為多酚類化合物及不皂化物。

3 結論

本實驗研究了樟樹籽油抗氧化活性，測定了其抗氧化活性組分，樟樹籽油中多酚組分和不皂化物具有較好的DPPH自由基清除能力，二者對樟樹籽油DPPH自由基清除能力的總貢獻率高達89.04%，但針對樟樹籽油中多酚化合物及不皂化物的組成及其與樟樹籽油抗氧化活性的關系有待進一步研究。