蕎麥種子高萌發(fā)率蟲生真菌菌株的篩選

彭雪,吳煜,張曉娜*,陳萬浩,朱麗偉,陳慶富*,鄧嬌

蕎麥種子高萌發(fā)率蟲生真菌菌株的篩選

彭雪1,吳煜1,張曉娜1*,陳萬浩2,朱麗偉1,陳慶富1*,鄧嬌1

1. 貴州師范大學 蕎麥產業(yè)技術研究中心, 貴州 貴陽 550001 2. 貴州中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 菌物藥研究中心, 貴州 貴陽 550025

篩選促進蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌株，為研究蟲生真菌對蕎麥的促生機制提供理論基礎，本文采用4種蟲生真菌16株菌株的芽孢子和分生孢子懸液以1×106個/mL的濃度浸種2個品種6個品系的蕎麥種子，獲得對蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌株。結果表明，16株蟲生真菌菌株均可提高蕎麥種子的萌發(fā)率、芽長和芽直徑長度，且對米苦蕎種子的促生作用大于甜蕎；多數分生孢子對萌發(fā)率、芽直徑的促生作用較芽孢子效果好，多數芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。

蕎麥; 種子萌發(fā); 蟲生真菌

蕎麥屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（），約有23個物種，其中甜蕎（）和苦蕎（）是兩個主要的糧用栽培種。目前蕎麥的消費產品主要以其種子加工后的食品為主，如饅頭、面包、面條、糕點[1]等食物，其富含的淀粉、黃酮類物質、礦物質等保健成分，具有“三降”（降血壓、降血糖、降血脂）、“三抗”（抗氧化、抗炎、抗癌）等功能[2-4]，使其成為集營養(yǎng)、醫(yī)療、保健為一體的重要糧藥兼用作物[5]。

種子萌發(fā)是預測后續(xù)植株發(fā)育和農業(yè)產量的關鍵階段。如何在保證安全的情況下既能提高其萌發(fā)率、出苗率，又能促進其芽苗的生長，成為研究者關注最高的問題。目前，用于促進蕎麥種子萌發(fā)的技術與方法主要有超聲波處理[6]、添加赤霉素、吲哚乙酸[7]等植物生長調節(jié)劑，使用硼肥溶液[8]，改變溫度和光照[9]，去果皮[10]等，但化學添加劑對生物和環(huán)境有一定的負面影響，其它方法耗時耗力且不能大規(guī)模有效的應用于生產實踐中，因此迫切需要尋找新的安全的生物技術來促進種子萌發(fā)。

蟲生真菌(Entomopathogenic fungi)以其能夠寄生于昆蟲、蜘蛛等節(jié)肢動物中致其死亡，又對人畜無危害、環(huán)境無污染[11]，且在自然狀態(tài)下或通過人工接種的方式（如葉面噴施、傷口涂抹、注射法、浸種法、根莖浸沒、種子包衣等）定殖于植物中，促進植物生長、免受病蟲害侵擾而備受青睞[12-15]。

因此，本文擬研究環(huán)鏈棒束孢、粉棒束孢、蝙蝠蛾擬青霉、玫煙色棒束孢4種蟲生真菌的16株菌株對米13、米18、米55、1412-16、貴甜2號、紅甜1號6個蕎麥品系種子的浸種實驗，獲得對蕎麥種子萌發(fā)效果最佳的蟲生真菌菌種和菌株，探究蟲生真菌對蕎麥種子萌發(fā)的影響，以期為進一步研究蟲生真菌與蕎麥的相互作用機制提供材料及理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試蕎麥品種：共2個品種6個品系，分別為米苦蕎（米13、米18、米55），甜蕎（貴甜2號、1412-16、紅甜1號），均由貴州師范大學蕎麥產業(yè)技術研究中心提供。

供試菌株：此試驗中菌株1、6號為貴州中醫(yī)藥大學陳萬浩博士饋贈，其他菌株均由貴州師范大學蕎麥產業(yè)技術研究中心提供（表1）。

表 1 供試蟲生真菌菌株

1.2 試驗方法

1.2.1 材料預處理芽孢子懸液制備：在試管中挑取菌絲接種到150 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在150 r/min、25 ℃的恒溫搖床中培養(yǎng)5 d，用雙層擦鏡紙過濾菌懸液，獲得芽孢子懸液。用血球計數板計數，測定孢子濃度，用無菌水將孢子懸液濃度稀釋至1×106個/mL。

分生孢子懸液制備：將供試菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d，待培養(yǎng)基上長滿菌落，用0.05%吐溫-80無菌水洗滌，并用雙層擦鏡紙過濾，獲得分生孢子懸液。用血球計數板測定孢子濃度，用0.05%吐溫-80無菌水將孢子懸液濃度稀釋至1×106個/mL。

1.2.2 消毒將選取的蕎麥種子進行表面消毒，先用無菌水清洗1遍，再用70%的無水乙醇浸泡1 min，25%的次氯酸鈉表面消毒1 min，最后用無菌水清洗表面的次氯酸鈉殘留液，清洗3次，將最后一次清洗種子的無菌水取1滴進行培養(yǎng)，連續(xù)觀察5 d發(fā)現無菌長出，則為消毒成功。

1.2.3 浸種將每種蕎麥的30粒種子置于1.2.1中制備的15 mL孢子懸液中完全浸沒，于室溫下浸種2h，對照組分別用液體培養(yǎng)基和0.05%吐溫-80無菌水浸種，條件與實驗組一致。

1.2.4 培養(yǎng)將浸種后的種子以每種30粒，5顆/每行*6行的方式置于發(fā)芽盒（12×12 cm）中，3個重復，在溫度為25±1 ℃，相對濕度為70±5%，光照周期L:D=12:12的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)3 d，露白即視為萌發(fā)，每天記錄萌發(fā)數，第3 d用游標卡尺測量其芽長和芽直徑。

1.3 數據分析

萌發(fā)率（%）=(萌發(fā)種子總數/供試種子總數)×100%。

萌發(fā)指數()=∑(/)，為第日的萌發(fā)種子數，為相應的萌發(fā)天數。

用Excel 2010進行基礎數據統(tǒng)計分析和作圖，SPSS 24.0軟件進行統(tǒng)計分析，應用獨立樣本檢驗方法在0.05水平對兩組數據進行差異顯著性分析，采用Tukey法在0.05水平對多組數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子萌發(fā)率的影響

如表2、3、4、5、6、7所示，用16株蟲生真菌菌株的芽孢子、分生孢子懸液分別對米苦蕎和甜蕎進行浸種后，種子萌發(fā)率隨時間的延長而增加，除貴甜2號與對照組無顯著性差異外，實驗組的萌發(fā)率、萌發(fā)指數均高于對照組，同一天同一菌株對比芽孢子、分生孢子懸液對米苦蕎種子萌發(fā)率結果發(fā)現差異不顯著。

第3 d菌株4、7號芽孢子懸液和菌株13號分生孢子懸液浸種的米13種子萌發(fā)率最高，分別為96.67±3.33%和97.78±1.92%，分別是對照組的1.13倍和1.17倍（表2）；菌株1、5號的芽孢子和菌株12號分生孢子浸種的米18種子萌發(fā)率達100%，分別是對照組的1.07倍和1.09倍（表3）；菌株10號芽孢子懸液和菌株12號分生孢子懸液浸種的米55種子萌發(fā)率最高，分別為100.00±0.00%和98.89±1.92%，分別是對照組的1.11倍和1.21倍（表4）。

相較米苦蕎種子，甜蕎種子前3 d萌發(fā)率、萌發(fā)指數均較低，其中菌株5號芽孢子懸液和菌株3號分生孢子懸液浸種的1412-16種子萌發(fā)率最高，分別為31.67±2.36%和35.00±2.36%，分別是對照組的14.27倍和15.77倍（表6）；菌株5號芽孢子懸液和菌株8號分生孢子懸液浸種的紅甜1號種子萌發(fā)率最高，分別為48.33±7.07%和56.67±4.72%，分別是對照組的3.63倍和3.64倍（表7）。

表 2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米13萌發(fā)率的影響

注：表中所有數據為平均值±標準誤，同列不同小寫字母表示同列不同菌株之間差異顯著（<0.05），“*”表示同一天同一菌株分生孢子與芽孢子之間差異顯著（<0.05）。下同。

Note: The data are presented as the mean ± SE.The different lowercase letters in the same column present significant differences among the different strains in the same column at<0.05. “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at< 0.05. The same as follows.

2.2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽長的影響

如圖1所示，用16株蟲生真菌的孢子懸液浸種后，不同菌株、不同孢子懸液對不同品種種子芽長的影響不同，米苦蕎中，除菌株2號的芽孢子懸液和菌株5、9號分生孢子懸液外，其他菌株實驗組芽長均高于對照組，其中菌株8號芽孢子懸液和菌株6號的分生孢子懸液對米13、米18的促生效果最好，菌株5號的芽孢子懸液和菌株6號的分生孢子懸液對米55芽長促生效果最好（圖1A、1B、1C）；相較米苦蕎，蟲生真菌對甜蕎種子芽長的促生效果較小，其中菌株15號、8號的芽孢子和菌株6號、7號、4號的分生孢子分別對紅甜1號、貴甜2號、1412-16的促生效果最好（圖1D、1E、1F）；芽孢子和分生孢子相較，除1412-16和貴甜2號，多數芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。

表 3 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米18萌發(fā)率的影響

表 4 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對米55萌發(fā)率的影響

表 5 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對貴甜2號萌發(fā)率的影響

表 6 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對1412-16萌發(fā)率的影響

表 7 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對紅甜1號萌發(fā)率的影響

注：“*”表示同一菌株分生孢子與芽孢子差異顯著（?0.05）。

Note: “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at the< 0.05.

2.3 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽直徑的影響

如圖2所示，用16株蟲生真菌菌株的孢子懸液浸種后，不同菌株、不同孢子懸液對不同品種種子芽直徑的影響不同。米苦蕎中，多數菌株的分生孢子較芽孢子效果好，菌株1號的芽孢子和菌株9號的分生孢子對米13的芽直徑促生最快；菌株2號的芽孢子和菌株14、15號的分生孢子對米18的芽直徑促生最快；菌株1、2號的芽孢子和菌株16號的分生孢子對米55芽直徑促生最快（圖2A、2B、2C）。

相較米苦蕎，蟲生真菌對甜蕎芽直徑的作用較弱，但多數蟲生真菌對芽直徑有促進作用，極少數（如2號、12號）不顯著，且多數分生孢子效果較芽孢子好，菌株9號的芽孢子懸液和菌株6號的分生孢子懸液對紅甜1號芽直徑促生最快；菌株5號的芽孢子懸液和菌株3號的分生孢子懸液對1412-16的芽直徑促生最快；菌株5號的芽孢子懸液和菌株7號的分生孢子懸液對貴甜2號的芽直徑促生最快（圖2D、2E、2F）。

圖 2 16株蟲生真菌菌株的孢子懸液對蕎麥種子芽直徑的影響

注：“*”表示同一菌株分生孢子與芽孢子差異顯著（?0.05）。

Note: “*”presents the significant differences between the aerial conidia and submerge conidia of the same srains on the same day at< 0.05.

3 結論與討論

蟲生真菌可通過浸種的方式定殖于植物促進其生長。用球孢白僵菌孢子懸液浸種牛蒡，可促進其生長[16]；用白僵菌、玫煙色棒束孢浸種大豆，可提高植株的株高和地上、地下部分的干鮮重[17]；用環(huán)鏈蟲草浸種番茄，對其生長有顯著促進作用[18]；本文用環(huán)鏈棒束孢、粉棒束孢、蝙蝠蛾擬青霉、玫煙色棒束孢4個菌種的孢子懸液浸種蕎麥種子，不僅能夠提高蕎麥種子的萌發(fā)率，還可促進芽長的生長，與前者研究相似，這也進一步驗證了蟲生真菌的促生作用。

雖然蟲生真菌對作物有促生作用，但不同菌種、不同菌株、不同孢子懸液對不同作物品種的促生效果不同。Qayyum MA等的研究表明2株白僵菌可促進番茄生長，1株白僵菌則表現出減少地上部分干重和果實重量的副作用[19]。本文中菌株9號分生孢子懸液浸種的種子萌發(fā)率、芽長、芽直徑都顯著低于對照組，其余大部分菌株均能不同程度的促進種子萌發(fā)、芽長、芽直徑的生長。芽孢子與分生孢子懸液相比，多數分生孢子對萌發(fā)率、芽直徑促生作用較芽孢子效果好，多數芽孢子對蕎麥芽長的促生作用較好。用不同蟲生真菌對甜蕎和米苦蕎進行浸種后，米苦蕎全部萌發(fā)了，甜蕎種子并未全部萌發(fā)，這可能與蕎麥種子殼薄厚有關，以及菌株芽孢子和分生孢子所含碳水化合物的不同有關，但有待進一步驗證。

本研究首次證明了蟲生真菌對蕎麥種子的萌發(fā)有促進作用，且篩選出菌株12號的分生孢子懸液對米55種子的萌發(fā)效果最好，這將為研究蟲生真菌促進植物生長提供新的材料，為理解互作作用提供了新的思路。

[1] 李可心,周冉冉,陳茂彬,等.蕎麥功能性成分及相關食品開發(fā)[J].現代農業(yè)科技,2021(7):236-240

[2] 冉盼,楊麗娟,崔婭松,等.自交可育甜蕎、金苦蕎、米苦蕎17株品系總黃酮、粗蛋白及其蛋白組分含量研究[J/OL]. 廣西植物.https://kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134.Q.20201104.1338.010.html

[3] 張曉娜,吳煜,李斌,等.貴州省蕎麥地上節(jié)肢動物種類的調查研究[J].貴州師范大學學報(自然科學版),2020,38(3):45-52

[4] 周飄,張曉娜,陳慶富.水活度和溫度對苦蕎麥黃曲霉菌株MI18-S1生長和產毒的影響[J/OL].福建農業(yè)學 報:1-10[2021-03-15].http://kns.cnki.net/kcms/detail/35.1195.S.20200508.1724.002.html.

[5] 張啟迪.不同蕎麥品種種子蛋白質組分的比較研究[D].貴州:貴州師范大學,2017

[6] 卞紫秀,汪建飛,王順民.超聲波處理下苦蕎麥萌發(fā)及富集黃酮工藝優(yōu)化研究[J].安徽工程大學學報,2018,33(5):7-13

[7] 王宏信,楊素丹,劉紅梅.17株植物生長調節(jié)劑對金蕎麥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].種子,2017,36(5):19-22

[8] 蔡天革,胡智馨,杜春明,等.不同質量濃度硼肥對蕎麥種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J].沈陽大學學報(自然科學 版),2021,33(3):213-219

[9] 何俊星,何平,張益鋒,等.溫度和鹽脅迫對金蕎麥和蕎麥種子萌發(fā)的影響[J].西南師范大學學報(自然科學版),2010,35(3):181-185

[10] 周兵,閆小紅,楊芳珍,等.果皮對17株甜蕎和苦蕎品種種子萌發(fā)特性的影響[J].井岡山大學學報(自然科學 版),2016,37(6):42-47

[11] 張杰,趙丹晨,張麗紅,等.環(huán)鏈棒束孢()殺蟲緩釋劑的制作[J].江蘇農業(yè)科學,2020,48(3):119-124

[12] 路楊,徐文靜,隋麗,等.球孢白僵菌植物內生性及其應用研究進展[J].東北農業(yè)科學,2016,41(1):73-77

[13] Quesada-Moraga E, López-Díaz C, Landa BB. The hidden habit of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana: first demonstration of vertical plant transmission [J]. PLoS ONE, 2017,9(2):e89278

[14] Vega FE. Insect pathology and fungal endophytes [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2008,98(3):277-279

[15] Sasan RK, Bidochka MJ. The insect-pathogenic fungus(Clavicipitaceae) is also an endophyte that stimulates plant root development [J]. American Journal of Botany, 2012,99(1):101-107

[16] 蒙怡,查錦宏,朱蘊蘭,等.球孢白僵菌定殖對牛蒡苗生長特性的影響[J].安徽農業(yè)科學,2021,49(10):134-137

[17] Dash CK, Bamisile BS, Keppanan R,. Endophytic entomopathogenic fungi enhance the growth ofL. (Fabaceae) and negatively affect the development and reproduction ofKoch (Acari: Tetranychidae) [J]. Microbial Pathogenesis, 2018,125:385-392

[18] 管景強,許忠順,劉京,等.環(huán)鏈蟲草對番茄生長和抗氧化酶活性的影響[J/OL].微生物學 報:1-15[2022-03-05].DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20210408.

[19] Qayyum MA, Wakil W, Arif MJ,. Infection of Helicoverpa armigera by endophytic Beauveria bassiana colonizing tomato plants [J]. Biological Control, 2015,90:200-207

Screening of High Germination Rate Strains of Entomopathogenic Fungi against Buckwheat Seeds

PENG Xue1, WU Yu1, ZHANG Xiao-na1*, CHEN Wan-hao2, ZHU Li-wei1, CHEN Qing-fu1*, DENG Jiao1

1.550001,2.550025,

To provide a theoretical foundation for studying the mechanism by which entomopathogenic fungi promote buckwheat seed germination by screening the best entomopathogenic fungi strains. The submerged conidia and aerial conidia suspensions of 16 strains of 4 entomogenic fungi were used in the present study to infiltrate 6 varieties of 2 strains of buckwheat seeds at a concentration of 1×106conidia/mL, and the best entomogenic fungi strains with the best germination effect on buckwheat seeds were obtained. It was found that 16 entomopathogenic fungi strains could improve the germination rate, bud length, and bud diameter of buckwheat seeds, withseeds having a more significant effect on growth thanseeds. In general, aerial conidia exhibited a greater growth-promoting effect on germination rate and bud diameter than submerged conidia. However, most of the submerged conidia exhibited a greater growth-promoting effect on the buckwheat bud.

Buckwheat; seed germination; entomopathogenic fungi

S517

A

1000-2324(2022)03-0393-08

10.3969/j.issn.1000-2324.2022.03.009

2022-04-15

2022-07-01

教育部重點實驗室開放課題基金(黔教合KY字[2020]246);貴州師范大學資助博士科研項目(11904/0517052)

彭雪(1998-),女,在讀研究生,研究方向:害蟲生物防治研究及病原微生物利用. E-mail:2286839081@qq.com

Author for correspondence. E-mail:1263432172@qq.com; cqf1966@163.com.