隆林黃牛、潿洲黃牛冷凍精液制作的研究

文│鄧祝新 黃麗云 劉瑞鑫 許春榮 王英群 洪少鋒 李美珍 何復明 許鵬 方奕雄 蔣世強 魏莎*（廣西壯族自治區畜禽品種改良站）

廣西壯族自治區畜禽品種改良站積極響應國家政策的號召，打好種業翻身仗，積極推進《廣西地方家畜品種遺傳材料采集與保存》項目。其中，對廣西地方品種進行遺傳材料采集，并且獲得了明顯的成效，對廣西畜牧種業做出重要貢獻。隆林黃牛、潿洲黃牛具有以下特性：

（1）兩者屬于放養型黃牛，野性比較強，人工比較難馴服，增加了人工采精的難度。

（2）兩者飼養基本都是單純以進食青草為主，性欲差，精液稀。究其原因，為提高公牛性欲和精液量，在公牛飼養中進行圈養、隔離調教，增加蛋白性飼料投入，最終達到預期效果。鮮精活力完全達到制作冷凍精液的要求。

一、黃牛鮮精的采集

使用法國卡蘇公司專售的IMV采精筒，用75%的酒精進行全面消毒，晾干，裝好后備用。采精筒水溫控制在45～50℃，內胎氣壓要充足，充滿整個采精筒內胎，最好形成三角形裂口，涂少量專用潤滑劑在采精筒內壁，保護公牛陰莖插入時不受傷。固定好臺牛，等待公牛爬跨時，采精員迅速將采精筒套入公牛陰莖，收集牛精，待公牛下滑時拿開采精筒。采集結束后放水，排氣壓。取出集精杯，將精液送到實驗室窗口內，浸泡在37℃的恒溫水浴鍋內。注意事項：如果采精筒的水溫低于45℃或高于50℃時采精筒的內膽溫度并不合適牛陰莖的感受溫度，嚴重影響精液采集是否成功，甚至讓公牛發怒，產生抵觸不再爬跨。如果內膽溫度過高，在采集牛精的同時部分精液流經內膽時，精子會因溫度過熱而被燙死一部分，人為造成損失。

二、黃牛鮮精的鏡檢與稀釋

1.黃牛鮮精稀釋液直接采用了法國卡蘇公司的產品（BIOXCELL freezing medium for bull semen，稀釋液250 毫升/瓶）。必須使用雙蒸高壓滅菌蒸餾水，按照1∶4的比例配制等溫混合均勻后放置于35℃的恒溫水浴鍋內待用。

2.接到集精杯后輕輕搖勻精液，用肉眼觀察精液顏色是否有異常或雜質。合格的精液做好采精記錄，取10微升原精進行顯微鏡鏡檢，觀察精液情況，活力達到0.7以上且無雜質、無污染、死精少的原精可以使用（一般鮮精活力在0.6以下的不建議制作冷凍精液），接著用密度儀測量精子密度，2.4毫升（0.9%氯化鈉）＋100微升的原精，放到比色皿中搖勻，放入卡蘇IMV光譜密度儀中測量，按照密度儀的提示量進行稀釋。重點要求：

（1）稀釋過程中一邊搖勻一邊取樣鏡檢觀察精子情況，直到稀釋合適為止，加稀釋液總量一般不超過推薦量。

（2）稀釋液和牛精液要同時浸泡在37℃的水浴鍋中，以達到兩者溫度一致，在稀釋時減少溫差對精子活力的影響。

（3）稀釋完成后，將精液浸泡在水浴鍋中等待分裝，稀釋間的室溫要求在25℃左右，稀釋后的精液溫度基本維持在26℃左右，目的是讓精子從采集出來到稀釋完成的整個過程中逐級降溫。稀釋后要求每支0.25毫升細管內總精子數在3000萬以內，有效精子數為800～1000萬個，少于800萬個有效精子數的為不合格產品。

三、黃牛鮮精的灌裝與平衡

稀釋后的牛精液分裝到0.25毫升容量的細管中，筆者使用法國卡蘇公司生產的IS4全自動精液灌裝一體機、多米諾A系列噴碼機，聯合灌裝成產品。每支0.25毫升細管內有效精液含量在0.185～0.21為合格產品。重點要求：

（1）灌裝的同時必須搖勻精液，達到分裝均勻的效果。

（2）精液灌裝的室溫控制在23～25℃為佳，讓精液再次逐級降溫。防止精液溫度回升，如果溫度回升會對精液造成不可逆轉的損傷。

平衡的要求：灌裝完成后的細管精液從25℃左右的室溫立即放到開放式的平衡柜內。此時平衡柜的工作溫度為4～8℃。當所有細管精液在平衡柜內完成上托架、排管，約1小時穩定后，再把細管精液轉移到4℃的密閉式恒溫柜內靜置3～4個小時。此時是最關鍵的精子休眠期，禁止再次打開恒溫柜，防止精液回溫。

四、黃牛冷凍精液的制作過程

經過3個小時以上的平衡后進行冷凍。打開電腦冷凍程序，打開冷凍儀，開啟液氮閥門，并檢查液氮壓力，選擇牛冷凍精液制作專用程序，點擊進入冷凍程序。當冷凍程序提示冷凍柜達到4℃時迅速打開冷凍柜蓋子，將平衡好的細管精液放入冷凍柜對應的架子上，然后蓋上蓋子。等待約2分鐘后點擊開始冷凍。約7.5分鐘后冷凍結束，此時關掉風扇，戴上手套，取出細管凍精，迅速浸泡到液氮容器中，產品成型，冷凍結束。

五、黃牛冷凍精液的解凍與活率觀察

1.細管凍精的解凍檢查。將水浴鍋溫度調節至38℃，用溫度計測量實際水溫，38～39℃為最佳解凍溫度。選擇5毫升指型管，加入1毫升牛凍精解凍液，置于水浴鍋架子上浸泡，將一支冷凍精液取出，迅速浸泡到水浴鍋中解凍，均勻搖晃30秒以上，待溶解完后取出，擦干細管表面水分，減掉封口端，將精液完全擠到指型管解凍液內，水浴搖均勻，用移液槍取10微升進行鏡檢觀察。重點要求：解凍時，細管必須水浴搖晃，解凍時間30秒以上。水溫必須恒定在38～39℃，顯微鏡觀察時載物臺必須配備恒溫板。一塊玻片分別取3滴10微升精液在3個視野下進行觀察，綜合評定活力。0.35或0.35以上為合格，否則為不合格。

2.生產制作要點。

（1）采精工作中控制采精筒的內膽水溫才能采到好的精液。否則，黃牛爬跨時只射精清，并不是真正射精，導致采不到精液。

（2）在精液稀釋工作中，首先將鮮精搖勻，精液取樣位置不同，對精子密度測量值會有一定偏差，因此，在實際工作中一定要將理論值與實際值相結合，反復鏡檢看稀釋效果。

（3）必須做到逐級降溫，這是鮮精稀釋后最重要的部分，嚴格逐步降溫過程，禁止回溫，防止造成不可逆的損傷。平衡溫度嚴格要求在4℃，平衡時間要求穩定在3～4小時后才能進行冷凍制作。經測試，解凍溫度為38～39℃最合適，必須采取水浴解凍，將整支精液完全擠到解凍液內搖勻，取10微升滴片，鏡檢觀察活力。多看幾個視野內的精子，采取綜合評定。隆林黃牛、潿洲黃牛的公牛采集到的原精活力基本都在0.7以上，個別公牛原精偏稀，飼養管理過程中多增加精料，多運動，堅持公牛分欄飼養，以采到更好的精液，才能制作出更完美的凍精。