山羊溶血性曼氏桿菌病的診斷

文│蔣小剛（廣西壯族自治區畜牧研究所） 吳翠蘭 彭昊 李軍（廣西壯族自治區獸醫研究所，廣西獸醫生物技術重點實驗室）

溶血性曼氏桿菌為變形菌門、γ-變形菌綱、巴氏桿菌目、巴氏桿菌科、曼氏桿菌屬的成員，是一種革蘭氏陰性短桿菌的條件性致病菌，通常寄居在動物上呼吸道中。溶血性曼氏桿菌能感染山羊、綿羊、牛、鹿、狗、貓、鱷魚等多種動物。羊感染溶血性曼氏桿菌通常引起肺炎、新生羔羊急性敗血癥，給養殖行業造成重大經濟損失。2022年3月，廣西某羊場發生一起溶血性曼氏桿菌病的病例，現將診斷結果報道如下。

一、臨床癥狀和病理變化

廣西某羊場存欄山羊約100頭，已按照既定免疫程序免疫口蹄疫滅活疫苗、小反芻獸疫弱毒疫苗和三聯四防疫苗，定期在飼料中添加驅寄生蟲藥。2022年3月，該養殖場從外縣購買30頭羊，購買10天后，部分羊只開始出現精神沉郁、采食減少，隨后表現為咳嗽、流鼻涕、發燒、呼吸困難等癥狀，發病率為36.7%（11/30）。對病死山羊進行剖檢，剖檢發現肺臟有出血，胸腔和腹腔有積液，肝、脾無明顯變化。

二、病料采集

無菌采集病死山羊的肺、胸腔積液及腹腔積液。

三、病原檢測

1.細菌分離。用接種環挑取采集的肺、胸腔積液、腹腔積液，在血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂平板上進行接種，37℃培養24小時后挑取單個菌落進行純培養，然后再挑取純化后的菌落進行革蘭氏染色、光學顯微鏡下鏡檢。細菌分離結果顯示，胰蛋白胨大豆瓊脂平板上出現光滑、圓潤的細小菌落，而血平板上出現β溶血的細小菌落，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌。

2.支原體分離。將采集的肺和積液充分研磨，混勻后取上清，一部分置于-20℃備用，一部分用0.45微米濾器過濾。再將濾液加入到支原體培養基上放置于含有5% CO2的培養箱中37℃培養4～5天。連續傳2代后，再用接種環劃線接種于支原體固體培養基上，放置于含有5%CO2的培養箱中37℃培養4～5天，觀察菌落生長情況。結果顯示，支原體液體培養基無明顯變色，固體培養基上也未有菌落生長，說明無支原體生長。

3.分離菌生化鑒定。采用細菌微量生化反應管對分離菌株進行生化指標測定，將純化的菌落接種于葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖、麥芽糖、山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶的生化鑒定管中，放置于37℃培養箱中培養24小時，觀察細菌生化特性。生化試驗結果顯示，該菌能發酵葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖和麥芽糖；而山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶為陰性反應。此結果與陸承平《獸醫微生物學》（第三版）的溶血性曼氏桿菌的特性相符合，初步判斷該分離株為溶血性曼氏桿菌。

4.PCR檢測。

（1）反應模板制備。以上述組織上清液和分離菌為樣本，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明提取組織上清和分離菌的DNA，然后-20℃保存，備用。

（2）PCR引物。參考吳翠蘭等文獻合成綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）PCR鑒定。分別以上述組織上清液和分離菌的DNA為模板，以綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌特異性引物為引物進行PCR擴增，反應程序為95℃預變性5分鐘；然后進行30個循環95℃變性30秒、49～53℃退火40秒、72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分鐘。擴增結束后，取7微升PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，觀察電泳結果。

（4）電泳結果。電泳結果發現，組織上清液模板和分離菌的DNA模板均擴出溶血性曼氏桿菌目的條帶，表明該病原為溶血性曼氏桿菌，該結果與前述生化鑒定結果相符合。而羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌特異性引物均未擴出相應條帶。

5.動物致病性試驗。將10只健康的昆明鼠隨機分成1個試驗組和1個對照組，試驗組每只小鼠腹腔注射分離菌（1×109CFU/毫升）0.3毫升，另一組每只小鼠則注射同等劑量的生理鹽水作為對照組，觀察小鼠的身體狀況，記錄結果。試驗組小鼠在注射后6小時開始出現行動緩慢、精神沉郁，在24小時內已有60%（3/5）的小鼠出現死亡。對死亡小鼠進行剖解，發現肺腫脹、充血。從小鼠肺中回收分離到的細菌。

6.藥物敏感性試驗。取100微升純培養的細菌均勻涂在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，然后用無菌鑷子分別夾取23種藥敏紙片貼在平板上，置于37℃培養24小時，測量各種藥敏紙片的抑菌圈直徑并判斷藥敏結果。結果顯示，該分離菌對羅紅霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢他啶、卡那霉素、壯觀霉素等6種藥物敏感；對頭孢曲松、利福平、青霉素、四環素、林可霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、環丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、復方新諾明等17種藥物耐藥，藥敏試驗結果見表1。

表1 藥敏試驗結果

四、診治結論

根據臨床癥狀、病理變化、細菌分離培養、支原體分離、分離株生化鑒定、PCR檢測、動物致病性試驗等，確定該起病例是由溶血性曼氏桿菌引起的。

關于該病的治療，首先對病羊進行隔離，對污染的羊圈和場地進行消毒處理。其次，采用敏感藥物卡那霉素和頭孢噻肟進行治療。再次，加強飼養衛生管理，消除各種誘發因素，防止寄生蟲侵襲，增強體質。經過治療后羊只病情逐漸好轉。

五、預防措施

羊病預防措施主要包括提高羊只抗病能力、做好環境衛生和消毒、疫苗接種、藥物預防和定期驅蟲。

1.提高羊只抗病能力。及時補飼，特別是正在發育的幼齡羊、懷孕和哺乳期的成年母羊進行合理補飼尤為重要。堅持自繁自養和嚴進嚴出的原則，不僅減少入場檢疫的工作量，還可有效避免因羊只引入而帶入新的傳染源。羊只只能從非疫區購入，經當地獸醫部門檢疫并簽發檢疫合格證明。到達該場后再經本場所在地的獸醫檢疫，隔離觀察42天，確認為健康者，經藥浴、驅蟲、消毒方可與原有羊群混養。

2.搞好環境衛生和消毒。凈化養殖場周邊環境，減少病原微生物的滋生和疫病傳播，對羊圈、活動場地及用具要經常清掃，保持潔凈、干燥。及時清除糞便和污物，堆積發酵。飼草飼料要盡量保持新鮮、清潔和干燥，防止發霉變質。羊場要建立切實可行的消毒制度，定期對羊舍、用具、地面土壤、糞便、污水、皮毛等進行消毒。

3.傳染病的預防接種。疫苗接種能激發羊只產生抗體，使其對該種疫病由敏感轉為不敏感。羊場應根據自身制定合理的免疫程序。

4.藥物預防和定期驅蟲。藥物預防是指定期將適量藥物拌入飼料中，或溶解在飲水中進行群體藥物預防。但長期使用藥物預防容易產生耐藥菌株，影響藥物的預防效果，因此，要經常進行藥敏試驗，選擇有高度敏感性的藥物用于防治，最好是將幾種藥物交替使用，這樣可以延緩耐藥性菌株的產生速度。此外羊體內或體表會存在一些寄生蟲，因此，還要定期驅蟲。

六、討論

溶血性曼氏桿菌是引起山羊呼吸道疾病的重要病原之一，其致病率較高，發病率達50%左右。溶血性曼氏桿菌病的發生往往是由于氣候變化、長途運輸等應激因素引起的，還可能是支原體等病原入侵機體而引起的繼發感染。該研究從調運的山羊中分離出1株具有致病性的溶血性曼氏桿菌，進一步證實山羊受應激時容易引起溶血性曼氏桿菌病。

在動物致病性試驗中，小白鼠在攻毒分離菌6小時后開始出現行動緩慢、精神沉郁的情況，在24小時內已有60%的小鼠出現死亡。剖解死亡小鼠發現肺腫脹、充血，同時，從小鼠肺中分離到該菌。說明該分離株具有很強的致病性。相關研究發現，溶血性曼氏桿菌的致病性與血清分型及毒力因子息息有關。目前溶血性曼氏桿菌共有12種血清型，分別為A1、A2、A5、A6、A7、A8、A9、A12、A13、A14、A16和A17，其中流行最廣的血清型是A1、A2、A6，其次為A7、A9、A11和A12。在相關報道中，羊溶血性曼氏桿菌的優勢血清為A1和A2，Fodor等對匈牙利山羊溶血性曼氏桿菌進行血清型分析，發現A2血清型占比為94%；郝敏等對四川省某羊場分離到的19株綿羊源溶血性曼氏桿菌進行血清型分型，結果顯示，7株為A1型，11株為A2型；江金歡等對西藏地區某養殖場分離出的1株綿羊源溶血性曼氏桿菌進行血清型分型，結果顯示，該分離株為A2型；Abay等對山羊源溶血性曼氏桿菌進行血清型分型，發現A1血清型占比最高，為43.5%，其次為A2和A7；王晨驍等發現陜西某奶山羊養殖場分離出的溶血性曼氏桿菌為A2型。而本次分離菌株屬于哪一種血清型還有待進一步確定。溶血性曼氏桿菌的毒力因子較多，如白細胞毒素、脂多糖、外膜蛋白、莢膜、黏附素等。白細胞毒素主要作用于反芻動物白細胞，引起白細胞的凋亡和壞死，還可引起溶血和血小板集聚。而本研究分離到的菌株有溶血現象，推測該分離株可能含有白細胞毒素。

本研究采用臨床上比較常用的23種藥物進行藥敏試驗，結果顯示，該分離菌對羅紅霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢他啶、卡那霉素、壯觀霉素等6種藥物敏感；對頭孢曲松、利福平、青霉素、四環素、林可霉素、恩諾沙星等17種藥物耐藥。由此可見，該菌株耐藥性較為嚴重。試驗結果前人報道的不太一致，說明不同地區、不同物種分離到的菌株其耐藥性存在差異，這可能與不同地區的免疫程序和用藥情況不同有關。因此，通過藥敏試驗可以篩選出敏感性藥物，進而對溶血性曼氏桿菌病進行預防與治療，避免該類疾病的過度傳染，造成重大經濟損失。

七、結語

本試驗從調運過程中發病的山羊體內分離出革蘭氏陰性短桿菌，經過鑒定為溶血性曼氏桿菌，并對小白鼠具有致死性。經藥敏試驗發現，該分離株對多種藥物耐藥，只對少量藥物敏感，研究結果對該場治療山羊感染的溶血性曼氏桿菌用藥提供了參考。