特香型酒曲儲存期霉菌的分離鑒定及對酒曲理化指標的影響

李嘉宇，楊玉蓉，朱棟才，李 杰，楊志龍，楊 濤，*

（1.中南林業科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.江西李渡酒業有限公司，江西 南昌 331725；3.湖南湘窖酒業有限公司，湖南 邵陽 422006）

特香型白酒主體香為清香帶濃香，細聞有焦糊香，濃、清、醬香型白酒特征兼而有之，但又不接近哪一種香型。“曲為酒之骨”，酒曲作為釀酒生產中的一種糖化劑、發酵劑與生香劑，在發酵過程中起著至關重要的作用，故有“有美酒必備佳曲”之說[1]。在釀酒生產過程中，酒曲在提高出酒率、降低糧耗、增加優質品率、保持香型穩定等方面有著重要的作用[2]。不同類型的酒曲能生產不同類型的酒。酒曲微生物是發酵產酒的本質原因，所以只要了解酒曲中微生物的習性與作用，就能夠對改善酒曲品質以及出酒的質量起到指導生產的作用。

國內有關酒曲的相關研究較多，但有關特香型酒曲霉菌控制則相對少見。劉效毅等[3]通過分子生物學對高溫大曲中的微生物進行序列分析，鑒定得到大曲中細菌主要是芽孢桿菌、放線菌、葡萄球菌、微球菌；霉菌主要是青霉、曲霉、毛霉、交鏈孢霉、莖點霉菌、球毛殼、散囊菌、紅曲霉。酒曲中霉菌的生長伴隨著大曲生產的整個環節，特香型大曲中霉菌類群占一定比例，數量能達到104CFU/g，主要是毛霉、青霉和曲霉[4-5]。霉菌能夠產生分解淀粉和蛋白質的酶，不同種類的霉菌能夠產生不同種類的酶，在不同的發酵條件下產生的酶種類與作用都不盡相同，其主要功能是分泌糖化酶、液化酶及蛋白酶，對分解釀酒原料中的淀粉、蛋白質等大分子物質具有積極的推動作用，使得整個反應體系中糖類及氨基酸含量升高，可為其他微生物的代謝提供基礎物質，亦為后續的酒體風味形成奠定基礎[6-8]。霉菌的主要來源為空氣、場地、原輔料、母曲及人體[9]。隨著白酒工藝的日漸發展，消費群體層次的改變，白酒行業也在不斷進行著改革創新，人們對白酒的品質要求也日漸提高。特香型酒曲的貯藏期在3～6個月不等[10]，如何保證酒曲在貯藏期的品質質量現已成為了各個酒廠的關鍵問題。酒曲在貯藏期最常見的質量問題就是長霉，適量的霉菌在酒曲中有加強風味、提高酒曲質量的作用[11]。但是霉菌過多則會使得酒曲出現霉變結塊、有雜質、風味不純等問題。如若使用了這些霉變酒曲釀酒會使酒體帶有邪雜味，色澤與醇厚感也會大打折扣，還對人體健康有很大的威脅[12]。

本研究以江西某企業提供的不同質量特香型酒曲為原料，測定了霉菌二次生長大曲的理化指標，并對毛霉的理化性質、對酵母產酒精能力的影響進行分析，為后續特香型大曲的防霉抑霉工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗樣品

同一批次霉菌二次生長曲樣（霉心曲塊、霉曲整塊）與正常曲樣（好曲整塊）若干：江西某特香型酒企提供；米根霉（Rhizopus oryzae）1號、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：保存于中南林業科技大學食品科學與工程學院。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、可溶性淀粉、碘、碘化鉀、DL5 000 Marker（均為分析純或生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.3 培養基

A：馬鈴薯葡萄糖培養基（potato dextrose agar，PDA）：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，17 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水。115 ℃滅菌20 min。

B：PDA+大曲浸出汁（10%）：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，17 g瓊脂，900 mL蒸餾水，100 mL大曲浸出汁。

大曲浸出汁液（10%）：將100 g正常曲樣搗碎，加900 mL水，振蕩1 h，過濾，棄去濾渣，收集大曲浸出汁。115 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

AC2-2E8超凈工作臺：新加坡藝思高科技有限公司；YXQ-50A立式高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；MIR-150A恒溫培養箱：上海三騰儀器有限公司；YCW-160B搖床：上海捷呈實驗儀器有限公司；3730XL測序儀、2720 thermal cycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國Applied Biosystems公司；Legend Micro17離心機：Thermo公司；JY300C電泳儀、JYDF電泳槽、JY04S-3C凝膠成像儀：北京君意東方電泳設備有限公司；DFD-700水浴鍋：北京中興偉業儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒曲樣品菌群分析方法

內部轉錄間隔區核糖體脫氧核糖核酸（internal transcribed spacer ribosomal deoxyribonucleic acid，ITS rDNA）擴增子測序，是通過特異性引物擴增樣本中原核生物ITSrDNA的可變區，構建高通量測序文庫并對ITS rDNA可變區序列進行分析，從而鑒定環境中原核微生物的組成與豐度的方法。ITS rDNA擴增子測序的實驗流程包括樣本基因組DNA的提取與質檢、ITS rDNA可變區擴增與測序文庫構建、高通量測序等多個步驟，該部分操作委托蘇州金唯智公司進行測試，將所有優化后的序列與物種操作單元（operational taxonomic units，OTU）代表序列進行比對，與OTU代表序列相似性在97%以上的序列為同一OTU，統計生成OTU豐度表。

1.3.2 特香型大曲理化指標的測定

水分測定：使用差重法，將大曲試樣置于101 ℃條件下烘干3 h并取出冷卻稱質量，重復試驗直至質量恒定（精確至0.001 g）[13]。

糖化力測定：使用滴定法，參考QB/T4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]。空白對照記錄其消耗葡萄糖體積為V1，正式實驗記錄其消耗葡萄糖體積V2，糖化力按下式計算：

式中：X1為糖化力，mg/（g·h）；V1、V2是消耗葡萄糖溶液體積，mL。

淀粉含量測定：參考QB/T4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

液化力測定：制備5%酶液，使用比色法測定液化力，參考QB/T4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》，記錄下反應時間t。液化力以下式計算：

式中：X2為液化力，g/（g·h）；V是酶液定容體積，mL。

酸度測定：取大曲試樣10 g，加無菌水200 mL，常溫振蕩30 min，收集濾液。吸取樣液20 mL加無菌水30 mL，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至pH為8.2，記錄氫氧化鈉溶液體積V1，同時做空白實驗，記錄體積V0，酸度以下式計算[15]：

式中：X3為酸度，mmol/10 g；c為氫氧化鈉溶液濃度，mol/L；V1、V0是消耗氫氧化鈉溶液體積，mL。

1.3.3 霉菌的分離鑒定

取霉菌二次生長明顯的大曲，將發霉部分（約10 g）取下，加入90 mL無菌水，放入錐形瓶中振蕩1 h，將其孢子完全振蕩至懸液中。以涂布的方式將上述孢子懸液涂布至A、B兩種培養基中，30 ℃備用。使用DNA提取試劑盒提取DNA，進行PCR擴增、凝膠電泳。ITS rDNA擴增子的引物對為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。菌種鑒定序列與美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行比對。ITS擴增體系為：1×PCR mix 45 μL、ITS1（10P）2 μL、ITS4（10P）2 μL、DNA模板1 μL。PCR擴增程序見表1。

表1 聚合酶鏈反應擴增程序Table 1 PCR amplification procedure

1.3.4 傘狀毛霉對酵母產酒精能力的影響

酵母產酒精能力的測定參照王犁燁等[16]的方法，將菌液濃度均為106CFU/mL的霉菌孢子懸液與釀酒酵母菌懸液以不同比例混合，以5%的接種量分別裝于有杜氏小管以及15 mL的PDA液體培養基的試管中，要確保杜氏小管內無氣泡，30 ℃搖床培養。每隔12 h觀察一次產氣情況并記錄杜氏小管內的氣體體積[17]。

1.3.5 pH適應性

配制PDA培養基后滅菌，在超凈臺中使用1 mol/LNaOH溶液或1 mol/L HCl溶液調整其pH值分別為5、6、7、8、9、10、11、12。將霉菌二次生長曲樣在30 ℃自然濕度條件下培養3 d，每隔12 h測其菌落直徑[18-19]。

1.3.6 溫度適應性

將接種霉菌的平板分別于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，自然濕度條件下培養3 d，每隔12 h測其菌落直徑[20]。

1.3.7 濕度適應性

將霉菌接種的平板分別于濕度70%、75%、80%、85%、90%、95%，30 ℃條件下培養3 d，每隔12 h測其菌落直徑[21]。

1.3.8 數據處理

運用Excel 2019進行數據收集處理，Origin 9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 OTU聚類分析

由表2可知，霉菌二次生長酒曲的OTU6毛霉為主要的二次生長霉菌，其數量顯著高于優質酒曲5～10倍。而在根霉OTU數量上，好曲要多于霉菌二次生長的酒曲。

表2 酒曲樣品OTU聚類分析Table 2 OTU cluster analysis of Jiuqu sample

2.2 特香型大曲理化指標測定

2.2.1 水分含量測定

大曲貯存的時間越長，成曲中的水分含量就越低，表明發酵產生的游離水分越多、揮發程度越好，大曲發酵的成熟度就越好。由圖1可知，霉心曲塊、好曲整塊、霉曲整塊的水分含量依次為14.5%、12.5%、11.7%。霉心曲塊水分含量最高，所以霉菌生長的最好；而霉曲整塊的水分含量比好曲整塊要低，分析原因是因為霉心處水分含量比整體高，能促進真菌細菌的生長繁殖，而微生物的大量繁殖會產生熱量，會導致周圍的曲塊水分蒸發[22-23]。

圖1 酒曲水分含量比較Fig.1 Comparison of moisture contents of Jiuqu

2.2.2 糖化力測定

糖化力是衡量酒曲糖化作用強弱最重要的指標，指的是酒曲中具有糖化作用的酶及微生物將淀粉轉化為糖的能力，酒曲糖化力的高低受到很多因素（如溫度、濕度、微生物生長情況等）的影響，是酒曲最為重要的理化指標之一。由圖2可知，好曲整塊、霉曲整塊、霉心曲塊的糖化力依次為818.6 mg/（g·h）、669.8 mg/（g·h）、622.8 mg/（g·h）。毛霉的糖化力本就比根霉要低很多，分析原因是因為酒曲中毛霉的二次生長影響了根霉的糖化作用。糖化力下降導致大曲糖化能力不足，淀粉轉化為糖的能力下降，曲中糖分減少[24]。

圖2 酒曲糖化力比較Fig.2 Comparison of saccharification power of Jiuqu

2.2.3 淀粉含量測定

由圖3可知，霉心曲塊、霉曲整塊、好曲整塊的淀粉含量依次為34.84 g/100 g、35.66 g/100 g、37.59 g/100 g，好曲整塊的淀粉含量最高。淀粉含量不足會導致轉化成糖分的含量降低，進一步導致酒精產量不足[25]。

圖3 酒曲淀粉含量比較Fig.3 Comparison of starch contents of Jiuqu

2.2.4 液化力測定

液化酶能夠水解淀粉，產生糊精、低聚糖和單糖，并為后續的發酵過程提供底物。由圖4可知，霉心曲塊、霉曲整塊、好曲整塊的液化力依次為0.168 g（/g·h）、0.216 g（/g·h）、0.259 g（/g·h）。液化力降低會使得酵母產酒精能力下降，無法將糖轉化為乙醇，使得酒精度不足，口感下降[26]。

圖4 酒曲液化力比較Fig.4 Comparison of liquefaction power of Jiuqu

2.2.5 酸度測定

酒曲的酸度大小可以反映出大曲復合曲香物質的強弱程度。由圖5可知，霉心曲塊、霉曲整塊、好曲整塊的酸度依次為0.65 mmol/L、1.12 mmol/L、1.54 mmol/L。其中霉心處的酸度低于特香型大曲酸度的最低值（0.8 mmol/10 g）。有可能是二次生長的霉菌抑制了產酸微生物的產酸代謝，導致其活性下降，產酸性能也隨之下降。

圖5 酒曲酸度比較Fig.5 Comparison of acidity of Jiuqu

2.3 分離霉菌的菌落形態及分子生物學鑒定

由圖6可知，通過微生物菌落形態觀察，菌落絮狀，初為白色或灰白色，后變為灰褐色，菌絲密集且成絮狀，頂端有黑色小點；顯微鏡下菌絲極少分隔，有分枝，無假根及匍匐菌絲。孢子囊較大、球形、頂生內含孢子量多。孢子囊孢子球形、橢圓形。孢囊梗單生、不成束，單軸分枝或假單軸樣分枝，初步判斷該菌為毛霉菌。由表3可知，菌株A3和A4與傘狀毛霉（Lichtheimia corymbifera）（BMU07174）同源性達100%，親緣關系最近，結合形態觀察，鑒定該毛霉為傘狀毛霉（Lichtheimia corymbifera）。

圖6 分離霉菌菌株的菌落形態Fig.6 Colony morphology of isolated mould strains

表3 菌株的同源性比對結果Table 3 Comparison results of homology of strains

2.4 傘狀毛霉對酵母產酒精能力影響

因為酵母在發酵過程中產生CO2和酒精，所以產CO2的量與發酵產乙醇的量具有對應關系，以此判斷酵母產酒精的能力[27-28]。由表4可知，空白實驗和全毛霉發酵的實驗中，培養基中沒有產生氣體。而全酵母實驗中產氣量為最多，達到了5 cm。在混菌發酵中，隨著傘狀毛霉比例的增加，產氣量下降，說明產酒精能力下降；但達到1∶1的接種量比之后，隨傘狀毛霉比例的增加，產氣量維持一定。

表4 釀酒酵母與傘狀毛霉比例對酵母產酒精能力的影響Table 4 Effect of Saccharomyces cerevisiae and Mucor umbellifera ratio on alcohol production of yeast

2.5 傘狀毛霉的生長特性

2.5.1 pH適應性

由圖7可知，pH值為7的時候霉菌的菌落直徑最大，pH越高霉菌的菌落直徑越小。在pH為12時，霉菌的生長環境最差，生長速率也最慢。pH的適應從強到弱依次為pH7＞pH9＞pH8＞pH6＞pH5＞pH10＞pH11＞pH12。雖然pH對毛霉菌落直徑有一定影響，但整體趨勢未發生太大變化，pH的適應范圍較大。說明pH值對霉菌生長的影響在一定范圍內十分有限，所以只需將pH值控制在5～11之間即可。

圖7 不同pH對傘狀毛霉生長的影響Fig.7 Effect of pH on the growth of Mucor umbellifera

2.5.2 溫度適應性

由圖8可知，霉菌在35 ℃時的與菌落直徑最大，低于35 ℃或高于40 ℃的生長速率與菌落直徑均有下降趨勢，其最佳生長溫度為35～40 ℃。溫度的適應性從強到弱依次為35 ℃＞40 ℃＞30 ℃＞45 ℃＞25 ℃。說明霉菌生長對溫度的要求是比較高的，而且對其生長的影響較大，溫度適應性的分界線也比較明顯。

圖8 不同溫度條件對傘狀毛霉生長的影響Fig.8 Effect of different temperature on the growth of Mucor umbellifera

2.5.3 濕度適應性

由圖9可知，相對濕度在80%時霉菌的菌落直徑與生長速率最大。在相對濕度低于70%或高于85%時，霉菌的生長受顯著抑制。相對濕度適應性從強到弱依次為80%＞75%＞70%＞90%＞85%＞95%。濕度適應性的分界線也比較明顯，且對毛霉有較大的的生長影響。

圖9 不同相對濕度對傘狀毛霉生長的影響Fig.9 Effects of different relative humidity on the growth of Mucor umbellifera

3 結論

通過比較不同質量大曲理化指標得知，如果一塊大曲的傘狀毛霉菌出現了二次生長的情況，其糖化力、液化力等重要的釀酒指標均會降低。而這些指標都是環環相扣的，淀粉通過糖化作用轉化為糖分，又通過液化作用產生酒精，每一個環節的能力都弱一些，最后出酒的風味就會大打折扣，使酒的糖度、酒精度、風味都遠低于標準。

通過對儲藏期二次生長霉菌的鑒定，得出特香型大曲儲藏期二次生長的霉菌為傘狀毛霉。傘狀毛霉的生長環境在pH5～10時差距并不明顯，儲藏期大曲的平均水分含量要控制在12.5%，儲藏溫度控制在25 ℃，環境相對濕度不要超過70%為最佳條件。