君豐大曲醬香白酒出池酒醅特性與各輪次基酒風味相關性分析

余碩文，佘榮書，韓興林，張嬌嬌，胡景輝，何猛超，蒙德俊，4，王德良*

（1.新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；3.貴州酣客君豐酒業有限公司，貴州 仁懷 564501；4.百色學院農業與食品工程學院，廣西 百色 533000）

醬香型白酒作為我國12大香型白酒之一，其釀造工藝最復雜，生產周期最長，參與發酵的微生物種類最多，而且酒體內涵豐富、醇厚，風味獨特，醬香突出，回味悠長，越來越受到消費者的青睞[1-2]。醬香型白酒是以高粱為原料，以大曲為糖化發酵劑[3-4]，經兩次投料，九次蒸煮，八次發酵，七次取酒，長時間貯藏，精心勾兌而成[5]。在烤出來的七個輪次的酒中，第1輪次酒稱為糙沙酒，生澀味重但產量較多；第2輪次酒稱為回沙酒，醇和略有澀味，產量為7個輪次最多[6-7]；第3～5輪次的酒稱為大回酒，其醬香味明顯，酒體豐滿，產量較高[8-9]；第6輪次的酒稱為小回酒，小回酒醇和，糊香好，味長，產量較低。第7輪次的酒稱為丟糟酒，丟糟酒醇和、有糊香，但味苦、槽味較大，產量是7個輪次中最低的[10-11]。眾所周知，醬香型白酒成品酒是由7個輪次的基酒按一定比例勾兌、儲藏而成。所以，輪次酒品質的優劣直接決定成品酒品質的高低[12-13]。

醬香型白酒各輪次基酒特點和品質各不相同，這與其不同輪次發酵過程中的溫度、濕度、微生物等因素不同有關。但是目前對于醬香型白酒發酵過程研究多集中在對于某一或某幾輪次酒醅中微生物研究以及輪次酒的風味物質研究。如胡峰等[14]采用了高通量測序揭示在下沙和糙沙期間，細菌優勢菌屬均為乳酸菌、乳酸桿菌屬、片球菌屬、魏斯氏菌屬。唐維川等[15]通過氣相色譜法（gas chromatography，GC）定量檢測白酒中的風味化合物，結果顯示，前兩個輪次的輪次酒中乙酸、乙酸乙酯和正丙醇含量極高，分別占14.77%～15.55%、14.16%～22.90%、37.78%～37.98%。而對于輪次酒的研究多集中在風味物質、感官分析方面[16-17]，如孟望霓等[18]通過氣質聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定不同輪次酒樣中的風味化合物，發現不同輪次所釀造基礎酒的風味化合物總量的變化趨勢以3輪次釀造為轉折點，1、2輪次基酒先升后降，3輪次基酒又上升。

君豐大曲醬香型白酒是以醬香型白酒傳統“12987”工藝釀制而成，但是目前對于醬酒型白酒輪次出窖酒醅特性研究尤其是關于君豐大曲醬香出窖酒醅特性研究較少，同時目前對于醬香型白酒的發酵過程研究多集中在某一輪次的理化、風味或者微生物的研究，但是關于醬香型白酒整個生產周期追蹤以及對于其輪次酒醅理化、微生物結構、風味以及相關性研究較少[19-20]。因此，本研究對君豐大曲醬香白酒七個輪次出窖酒醅及各輪次基酒進行全程跟蹤，采用中國酒業協會團體標準T/CBJ 004—2018《固態發酵酒醅通用分析方法》、氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、離子色譜（ion chromatography，IC）分析技術和高通量測序技術對出池酒醅的理化性質、揮發性風味物質以及微生物群落結構進行解析，并建立三者之間的相關性，系統闡釋醬香型白酒出池酒醅特性（理化性質、微生物菌群）與風味物質之間的關聯性，這對于醬香型白酒產量及品質的提升以及推動醬香型白酒智能化釀造具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型白酒第1～7輪次出窖酒醅及輪次基酒：貴州酣客君豐酒業有限公司。

TIANamp Bacteria 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；氫氧化鈉、葡萄糖、鹽酸、酒石酸鉀鈉、硫酸銅（均為分析純）：北京化工廠有限責任公司；甲醇、苯乙醇、丙二醇、丁二醇、糠醛、苯甲醛、丁酸、己酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯等標準品（均為色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

ICS-3000離子色譜分析儀（配EG40淋洗液自動發生器、電導檢測器和Chromeleon 6.80色譜工作站）：美國DIONEX公司；Clarns 600氣相色譜儀（配火焰離子檢測器（flame ionization ditector，FID））：美國Perkin Elmer公司；Agilent-1260高效液相色譜分析儀：美國Agilent公司；KQ100-DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；ABI GeneAmpR9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國ABI公司；DYY-8C電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 酒醅的取樣方法

酒醅：在準備出池的酒窖中，按照五點取樣法，分別在窖面、窖中、窖底三層，每層各設5個取樣點，共計15個取樣位點進行樣品收集，充分混合后作為此輪次出窖酒醅，保存4 ℃冰箱，用于后續的理化和微生物高通量測序分析。

1.3.2 酒醅的理化指標分析

水分、酸度、淀粉和還原糖含量：根據中國酒業協會團體標準T/CBJ 004—2018《固態發酵酒醅通用分析方法》檢測[21]。

1.3.3 酒醅中微生物菌群基因組DNA的提取及高通量測序

（1）總DNA 的提取[14]

稱取不同類型酒醅5 g用液氛速凍后迅速研磨。酒醅總DNA提取方法按照土壤DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）操作說明書。

（2）PCR擴增

為了保證所提取的基因組的濃度及純度，對其進行PCR擴增及產物純化，對細菌16S rRNA基因的V3-V4高變區進行PCR擴增，所用引物338F/806R（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'/55'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）；對真菌的內部轉錄間隔區（ITS1）進行擴增，所用引物為ITS5F/ITS1R（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'/5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR擴增體系（50 μL）：模板DNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2×TaqPCR Master Mix 25 μL，雙蒸水22 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min。

（3）Illumina MiSeq測序

將檢測合格樣品送往天津諾和致源生物信息科技有限公司，通過高通量測序（Illumina Miseq PE250）平臺進行高通量測序。

1.3.4 輪次酒中揮發性化合物分析[15]

輪次酒中揮發性化合物分析采用GC-FID 法。

GC條件：CP-WAX 57 CB毛細管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μm），升溫程序：起始溫度35 ℃，恒溫6 min；以4 ℃/min升溫至60 ℃；以6 ℃/min程序升溫至110 ℃，恒溫3 min，以6 ℃/min程序升溫至205 ℃，恒溫13 min。進樣量1 μL；載氣為高純氮氣（N2），流速1 mL/min，分流比10∶1；氫氣（H2）流速為45 mL/min；空氣流速為450 mL/min；檢測器溫度270 ℃；進樣器溫度240 ℃。

定性方法：采用外標法定性。定量方法：采用內標法半定量風味物質含量，內標物選用叔戊醇（1%）、乙酸正丁酯（1%）、2-乙基丁酸（1%）。

1.3.5 數據分析

實驗樣品均進行3次平行實驗，結果采用Excel 2016繪制不同輪次酒醅理化指標圖和主要風味物質圖，利用SPSS24.0進行斯皮爾曼相關性分析，氣泡圖采用GephiV0.92版本繪制。

2 結果與分析

2.1 醬香型白酒各輪次基酒出窖酒醅理化指標的變化規律

2.1.1 醬香型白酒各輪次酒醅水分變化規律

在白酒的釀造過程中，酒醅的水分含量至關重要。若水分含量過高，則酒醅中的好氧性微生物的生長繁殖受到抑制，會使得酒醅的透氣性差，容易造成酸敗；若酒醅中水分含量過低，則會不利于微生物的生長代謝活動。由圖1可知，酒廠窖池出窖酒醅的水分含量在40%～60%之間，其變化趨勢為：第1～3輪次酒醅水分含量不斷增加，分析認為這是人為控制的結果，為了保證出酒率；第3～5輪次酒醅水分含量有所下降，分析認為這是人為控制的結果，保證3～5輪次可以出好酒；第5～6輪酒醅水分含量增加，并在第6輪酒醅水分含量達到最高，第6～7輪酒醅水分含量略微下降，分析認為這是因為此時淀粉被逐漸消耗造成水分含量略有回升[22]。

圖1 不同輪次基酒出窖酒醅水分含量的變化Fig.1 Changes of moisture contents in unloading pit fermented grains of different rounds base liquor

2.1.2 醬香型白酒各輪次酒醅酸度變化規律

在白酒的釀造過程中，酒醅的酸度同樣作為重要指標來反映發酵情況，適宜的酸度有利于酒醅的糖化、糊化過程，有利于微生物正常的生長代謝，防止雜菌污染，有利于酒質品質的提升。本實驗采用酸堿滴定法測定了不同輪次中的醬香型白酒中的酸度并分析其變化，如圖2所示。

圖2 不同輪次基酒出窖酒醅酸度變化Fig.2 Changes of acidity in unloading pit fermented grains of different rounds base liquor

由圖2可知，酒廠出窖酒醅的酸度的變化趨勢為：第1～3輪次酒醅酸度不斷增加，最高值達到4.83 mmol/10 g，這可能是因為剛開始的時候，酒醅中酵母菌、醋酸菌這些生酸微生物的含量較多，并且占優勢，這些生酸微生物在生長繁殖過程中易產生乙酸等酸類物質，造成出窖酒醅的酸度不斷升高；第3～4輪次酒醅酸度平穩，此時的產酸微生物的數量和產酸能力處于平衡狀態；第4～6輪次酒醅酸度有所下降，第6～7輪次酒醅酸度上升，分析認為這與此時醋酸菌的數量及產酸能力有關[23]。

2.1.3 醬香型白酒各輪次酒醅還原糖含量變化規律

在白酒的釀造過程中，還原糖的含量反映了酒醅的糖化速度和發酵速度間的動態平衡情況。如圖3所示，酒廠出窖酒醅的還原糖含量的變化趨勢為：第1～4輪次酒醅還原糖含量不斷增加，并在第4輪酒醅中還原糖含量達到最高，最高值為2.38 g/100 g，分析認為可能是因為前期主要進行糖化酶產生菌的富集，糖化酶產生菌將淀粉轉化為還原糖，所以還原糖含量逐漸增高；第4～7輪酒醅還原糖含量總體有所下降（5輪次與6輪次之間有個略微回升的趨勢），分析認為此時酒醅微生物生長代謝消耗還原糖的速度相對較快[24]。

圖3 不同輪次基酒出窖酒醅還原糖含量變化Fig.3 Changes of reducing sugar contents in unloading pit fermented grains of different rounds base liquor

2.1.4 醬香型白酒各輪次酒醅淀粉含量變化規律

在白酒的釀造過程中，淀粉是微生物生長繁殖的主要來源，而且淀粉的含量與出酒率之間呈正比。如圖4所示，酒廠出窖酒醅淀粉含量整體呈現逐漸降低趨勢，開始的時候，淀粉的含量很高，但是隨著輪次的推移，微生物的數量逐漸增多，越來越多的淀粉需要轉化成還原糖供微生物消耗。越到后期，淀粉含量的下降速率越慢，這是因為在前期，可以利用的淀粉已經逐漸被轉化為還原糖被消耗掉，后期不可利用的變性淀粉所占的比例越來越高造成淀粉的消耗速率減慢[25]。

圖4 不同輪次基酒出窖酒醅淀粉含量變化Fig.4 Changes of starch contents in unloading pit fermented grains of different rounds base liquor

2.2 醬香型白酒各輪次酒醅微生物變化規律

進一步對茅臺地區大曲醬香白酒酒醅的微生物群落結構進行研究，結果見圖5。由圖5a可知，在輪次酒醅中細菌屬水平上，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、海洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、unidentified_Mitochondria、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）等為相對優勢細菌屬，其中Lactobacillus為第1輪次優勢菌屬，其相對豐度高達81.6%，占據主導地位，其次是片球菌屬（Pediococcus），相對豐度達到5.3%，第2輪次優勢菌屬為Acetobacter、unidentified_Mitochondria、Kroppenstedtia、Lactobacillus等；第3輪次Bacillus相對豐度最高，為42.2%，其次是Oceanobacillus（13.4%）和Kroppenstedtia（8.1%）等菌屬；第4輪次酒醅細菌屬中，Oceanobacillus、unidentified_Mitochondria的相對豐度較高，分別為19.6%、13.1%；unidentified_Mitochondria在第5輪次酒醅中有較高的相對豐度，為3.8%；第6輪次酒醅的優勢細菌屬為Ralstonia、unidentified_Mitochondria，分別達到46.5%和16.0%；在第7輪次檢出的細菌屬中，unidentified_Mitochondria的相對豐度最高，達到了21.9%。整體而言，Lactobacillus整體隨著輪次逐漸降低，unidentified_Mitochondria與之相反，整體呈現逐漸增加的趨勢，尤其是3輪次后，此時烤酒一般處于夏季，可以推斷出夏季更適合unidentified_Mitochondria的生長。另外，Bacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia隨著輪次呈現先增后降趨勢，在第3、4輪次具有較高的相對豐度，這可能是釀造品質較好輪次酒的微生物基礎。

圖5 不同輪次酒醅細菌（a）及真菌（b）在屬水平上相對豐度Fig.5 Relative abundance of bacteria (a) and fungi (b) in different rounds of fermented grains at genus level

由圖5b可知，在真菌的屬水平上，輪次酒醅的相對優勢菌屬有伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、釀酒酵母屬（Saccharomyces）等，其中Issatchenkia隨著輪次呈現先降后增趨勢，在3輪次達到最低的相對豐度，在1、5、6、7輪次為優勢菌種，尤其是5、6、7輪次相對豐度占比達到90%以上；第2、3輪次優勢菌屬為Pichia，相對豐度達到了72.8%和48.1%；而第4輪次優勢菌屬為Zygosaccharomyces，相對豐度達51.3%，不同輪次真菌優勢菌屬有較大的差異，菌群結構變化較大，這可能與環境溫度和水分含量的不同有關[20]。

2.3 醬香型白酒各輪次基酒風味化合物的變化

分別對輪次基酒揮發性風味物質含量進行GC-FID分析，結果見表1，不同輪次基酒揮發性風味化合物總含量結果見圖6。

圖6 不同輪次基酒中各類揮發性風味化合物總含量分析結果Fig.6 Analysis results of total contents of various volatile flavor compounds in different rounds base liquor

表1 不同輪次基酒揮發性風味化合物含量GC-FID分析結果Table 1 Results of volatile flavor compounds contents in different rounds base liquor analyzed by GC-FID mg/L

續表

由表1可知，不同輪次基酒中酯類化合物含量的變化先增高然后從第2輪次開始緩慢減少，最高值為10447.37mg/L；不同輪次基酒中醇類化合物含量的變化趨勢為開始快速下降然后從第4輪次開始緩慢增加，最低值為1 227.94 mg/L；不同輪次基酒中醛類風味化合物含量的變化趨勢為隨著輪次的增加先增加，后從第5輪次降低，最高值為1039.92mg/L；不同輪次基酒中酮類化合物含量的變化趨勢為隨著輪次的增加先增加，后從第5輪次降低，最高值為190.42 mg/L；不同輪次基酒中吡嗪類化合物含量隨著輪次的增加變化相對較小。

酯類化合物是醬香型白酒中的重要風味化合物，尤其是乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯，它可以賦予酒體一定的果香，在酯類化合物中，乙酸乙酯、戊酸乙酯等低碳脂肪酸乙酯呈現逐漸遞減的趨勢，乳酸乙酯、油酸乙酯等高碳脂肪酸乙酯呈現先增后降的趨勢，而同為4大酯的丁酸乙酯和己酸乙酯均呈現緩慢增加的趨勢，這與胡峰等[14]的研究結果相似；醇類化合物也是醬香型白酒中重要的風味化合物，適量的醇類化合物可以增加醬香型白酒的醇甜味，而過量的醇類化合物則會給醬香型白酒帶來苦味，正丙醇是酒精發酵的產物，可以賦予酒體水果香以及醇香，異丁醇具有酒精和雜醇油的氣味，異戊醇和活性戊醇均是雜醇油的主要成分，可以賦予酒體奶酪香和腐敗臭[26-27]，這4種高級醇都是酒體中重要的醇但是含量過高會引起上頭，這4種高級醇均隨著輪次的增加而呈現先減后增的趨勢，這與韓興林等[26]的研究結果相似，其3～5輪次的含量要明顯低于其他輪次，而3～5輪次的酒是整個生產周期中酒質最好的酒，所以可以推測在同一周期內，這4種高級醇的含量與酒的品質呈負相關；適量的醛類化合物可以賦予酒體杏仁香味以及草香，在醛類化合物中，糠醛的變化趨勢與醛類化合物的變化趨勢基本相同，而苯甲醛和乙縮醛均呈現波浪式變化，這與尚柯等[24]的研究結果基本相似；適量的酮類化合物和吡嗪類化合物可以增加酒體的焙烤香及堅果香，丙酮隨著輪次的增加而增加，而作為雙乙酰的還原產物、可以賦予酒體水果香、酶腐香、木香[28]的乙偶姻隨著輪次的增加呈現一個先增后降的趨勢，最高值為170.35 mg/L；在吡嗪類化合物中，可以賦予酒體焦糖香和牛奶香的四甲基吡嗪隨著輪次的增加也呈現一個先增后降的趨勢，最高值為3.22 mg/L；醛類化合物、酮類化合物及吡嗪類化合物均在第四輪次達到峰值，隨后從第五輪次開始降低，其3～5輪次的含量在7個輪次中最高。

由圖6可知，根據變化趨勢來看，輪次酒的風味化合物總含量呈現不斷降低的趨勢，第1輪次達到最高值，為26 687.46 mg/L（其中酯類化合物總含量為7 806.11 mg/L，醇類化合物總含量為18 494.52 mg/L，醛類化合物總含量為372.67 mg/L），第7輪次達到最低值，最低值為7 168.66 mg/L，有研究報道，淀粉的利用率越高，微生物就會越多，作為微生物發酵代謝產物的風味化合物數量就會增多[28]，是因為前兩輪次粉碎的原料高粱中有大量的淀粉可以利用，所以它的淀粉利用率就會慢慢增高，微生物含量就會隨之增高，風味化合物數量也隨之增高，而3輪次之后原料高粱中的淀粉漸漸被消耗，糊化的整粒高粱又不足以彌補，所以淀粉的利用率開始降低，其微生物含量也開始降低，風味化合物數量也隨之降低。

2.4 相關性分析

醬香型白酒不同輪次酒醅理化指標及微生物的主成分散點圖如圖7所示，7個輪次，20個微生物、4個理化指標被分到不同區域，其中淀粉、還原糖與畢赤酵母屬（Pichia）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、假絲酵母屬（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、克羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、毛霉屬（Trichocladium）分到同一區域，說明淀粉、還原糖與這些微生物相關性較大，這些微生物在很大程度上影響著淀粉、還原糖的數值；酸度、水分與芽孢桿菌屬（Bacillus）、Unidentified Chloroplast、海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、明梭孢屬（Monographella）分到同一區域，說明水分、酸度與這些微生物相關性較大。

圖7 不同輪次基酒酒醅理化指標及微生物的主成分散點圖Fig.7 Main components scatter diagram of physicochemical indexes and microorganisms in fermented grains of different rounds base liquor

不同輪次酒醅微生物-風味物質相關性氣泡圖如圖8所示，與風味物質關聯性最大的微生物是假單胞菌屬（Pseudomonas），其與辛酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯、亞油酸乙酯、苯乙醇、異丁醛、丁二醇右、異戊醛、戊酸乙酯、乙酸乙酯呈極顯著性相關，與乙酸異戊酯、棕櫚酸乙酯、正戊醇、正己醇、丙二醇、乙醛、月桂酸乙酯、丙酮、苯乙酸乙酯呈顯著性相關。片球菌屬（Pediococcus）是另一個與風味物質關聯性較大的微生物，其與油酸乙酯、硬脂酸乙酯、亞油酸乙酯、戊酸乙酯呈極顯著性相關，與乙酸異戊酯、辛酸乙酯、棕櫚酸乙酯、丙二醇、苯乙醇、乙醛、丙醛、異丁醛、2,3-丁二醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯呈顯著性相關。除此之外，畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）都是與風味物質相關性較強的微生物，其中Pichia與異戊醇、異戊酸乙酯、甲酸乙酯呈極顯著相關，與乳酸乙酯、甲醇、異丁醇、活性戊醇呈顯著性相關，Zygosaccharomyces與戊醇、乙偶姻呈極顯著性相關，與乳酸乙酯、乙縮醛呈顯著性相關，Candida與癸酸乙酯呈極顯著相關，與油酸乙酯、亞油酸乙酯、棕櫚酸乙酯呈顯著性相關。

圖8 不同輪次基酒酒醅微生物與風味相關性氣泡圖Fig.8 Correlation bubble chart between microorganisms in fermented grains of different rounds base liquor and flavor

3 結論

在醬香型白酒整個生產周期中，出池酒醅的水分含量、酸度、還原糖含量均是一個先增加后緩慢減低的趨勢，第4輪次最高，淀粉含量是一個不斷降低的過程，最低值為9.49%。在整個生產周期中共檢測到71種細菌屬和43種真菌屬。其中前二優勢細菌屬為：乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus），前二優勢真菌屬為：伊薩酵母屬（Issatchenkia）、畢赤酵母屬（Pichia）。風味化合物總含量呈現隨著輪次的遞增不斷下降的趨勢，第一輪次達到最高值，為26 687.46 mg/L。將理化指標與微生物之間進行相關性分析，結果發現淀粉、還原糖與畢赤酵母屬（Pichia）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）等相關性較大，酸度、水分與芽孢桿菌屬（Bacillus）、Unidentified Chloroplast、海洋芽孢桿菌（Oceanobacillus）等相關性較大；將風味物質與微生物之間進行相關性分析，結果發現與風味物質關聯性最大的微生物是假單胞菌屬（Pseudomonas）、片球菌屬（Pediococcus）、畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）。