6個白葡萄品種類黃酮物質差異分析

史 寧，彭文婷，盧浩成，何 非，王 軍*

（1.中國農業大學 食品科學與營養工程學院 葡萄與葡萄酒研究中心，北京 100083；2.農業農村部葡萄酒加工重點實驗室，北京 100083）

葡萄是世界上種植規模最大、產量最多的水果之一[1]，其中75%的葡萄被用來釀造葡萄酒[2]。2018年我國葡萄酒產量已經躋身世界前十，是最具葡萄酒生產潛力的國家之一[3]。葡萄酒在釀造過程中會產生大量皮渣，皮渣中含有豐富的酚類物質，占果實總酚含量的90%以上[4]。白葡萄在釀酒時，皮渣不經過浸漬和發酵過程，皮渣中的酚類物質幾乎沒有損失。

白葡萄皮渣中的酚類物質主要為類黃酮類物質，包括黃酮醇和黃烷醇兩大類，與葡萄酒中的輔色效應密切相關。GORDILLO B等[5]的研究結果顯示，發酵時添加一定比例的白葡萄皮渣能夠增強紅葡萄酒的顏色表現，證明了白葡萄酒副產物作為外源添加劑提高紅葡萄酒酚類潛力的可行性。類黃酮類物質不僅能夠賦予葡萄酒艷麗的顏色，其具有的獨特生物活性也能夠對人的身體起到有效的保健作用。黃烷醇是比較復雜的一類類黃酮化合物，包括黃烷醇單體和原花青素，主要存在于果皮和種子中，多項研究證明，攝入黃烷醇有利于人體健康[6-7]。黃酮醇主要存在于果皮中，其生物活性通常比其相應的黃酮物質更強[8]，具有抗過敏[9]、抗炎癥[10]、預防前列腺癌[11]、預防心血管疾病[12]和提高運動能力[13]等多種藥理功能，還有研究報道攝入黃酮醇能夠降低阿爾茲海默癥患病風險[14]。

葡萄酒產業要達到可持續發展，就需要進行減廢，將葡萄皮渣變廢為寶，為葡萄酒產業帶來更高效益。以往的研究多集中在分析紅葡萄果皮和種子中的酚類物質組成和含量上，而對白葡萄果皮和種子中的類黃酮物質關注較少。該研究對6個常見的白葡萄品種果皮和種子中的類黃酮物質進行檢測，以期為白葡萄皮渣的高效利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

本實驗所用‘霞多麗’（Chardonnay）、‘長相思’（Sauvignon Blanc）、‘小芒森’（Petit Manseng）、‘貴人香’（Italian Riesling）、‘雷司令’（Riesling）和‘維歐尼’（Viognier）白葡萄果實：采自中國農業大學上莊實驗站（40°08′12″N，116°10′45″E）的玻璃溫室。除‘霞多麗’為2015年定植、‘小芒森’2012年定植外，其余品種均定植于2014年。栽植密度為4.0 m×1.0 m，南北行向，水平葉幕，主干高度為2.2 m，每個種植穴定植2株，兩個龍干垂直于行向且反向延伸。葡萄園的管理采用常規管理，灌溉方式為滴灌。

1.1.2 試劑

類黃酮類物質標準品（槲皮素、兒茶素、表兒茶素、表棓兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、甲酸、甲醇、乙腈）（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；乙酸鈉、甲醇（均為分析純）：北京化工廠。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200系列高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀、Poroshell120 EC-C18色譜柱（150mm×3.0 mm，2.7 μm）、Agilent 1200系列高效液相色譜儀串聯離子阱、有可變波長檢測器（variable wavelength detector，VWD）、ZorbaxEclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent科技有限公司；BSA223S天平：賽多利斯有限公司；S63300HBT超聲波儀：上海冠特超聲儀器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機：北京博醫康實驗儀器有限公司；Micro 17R離心機：賽默飛世爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 果實樣品采集

‘長相思’、‘貴人香’和‘雷司令’于2018年8月21日采集，其余葡萄品種果實于2018年9月7日采集。每個品種共3次重復，每次重復選取10穗葡萄，隨機采集100粒發育正常且無缺陷的果實為樣品。樣品在液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱待測。

1.3.2 類黃酮類物質的提取

（1）凍干粉的制備

對葡萄果實進行剝皮/取籽，迅速將果皮/種子置于液氮中冷凍，用粉碎機打碎后，置于冷凍干燥機中凍干24 h，得到果皮/種子凍干粉。

（2）果皮黃酮醇的提取

提取果皮黃酮醇的具體操作如下[15]：準確稱取0.100 g果皮凍干粉于2 mL離心管中，加入1 mL體積分數50%甲醇水溶液，低溫避光超聲萃取20 min后，置于離心機中在4 ℃，8000r/min條件下離心5 min，轉移上清液到新的離心管中；將殘渣按上述操作再提取一次，最后將兩次提取的上清液合并搖勻，存于-80 ℃冰箱中待測。

（3）黃烷醇的提取

提取黃烷醇的方法參考LIANG N N等[16]的方法。提取游離黃烷醇的具體操作如下：準確稱取0.050 g果皮/種子凍干粉于2 mL離心管中，加入500 μL 70%丙酮水溶液（含0.5%抗壞血酸），充分振蕩后離心10 min（4 ℃，8 000 r/min），轉移上清液至5 mL離心管中。將殘渣按上述操作再提取兩次，上清液合并搖勻。加入400 μL上清液于2 mL離心管中，避光條件下氮吹至完全吹干。加入200 μL甲醇（含1%鹽酸）溶解，再加入200 μL乙酸鈉水溶液（0.2 mol/L）中和，搖勻后于-80 ℃冰箱中保存待用。提取裂解黃烷醇的具體操作如下：準確稱取0.100 g果皮/種子凍干粉于2.5 mL離心管中，加入1 mL間苯三酚緩沖液（50 g/L間苯三酚甲醇溶液，0.3 mol/L鹽酸，0.5%抗壞血酸），于50 ℃水浴中避光加熱20 min后，添加1 mL乙酸鈉（0.2 mol/L），反應終止。在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，轉移上清液至新的離心管中。將殘渣按上述操作再提取兩次，上清液合并搖勻，置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 類黃酮類物質的檢測

（1）黃酮醇的檢測

采用高效液相色譜儀串聯離子阱，樣品測定前經0.22μm水系濾膜過濾，進樣量50 μL。流動相A為水∶甲酸∶乙腈=865∶85∶50（V∶V），流動相B為水∶甲酸∶甲醇∶乙腈=215∶85∶450∶250（V∶V），流動相的流速為0.63 mL/min。洗脫程序根據文獻[17]進行設定。

（2）黃烷醇的檢測

黃烷醇的檢測采用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀。樣品測定前經0.22 μm水系濾膜過濾，進樣量1 μL。洗脫采用的流動相A相為0.1%的甲酸水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈-甲醇溶液50∶50（V/V）。檢測器為多反應監測模式。黃烷醇的洗脫程序根據文獻[17]分別設定。

1.3.4 類黃酮類物質的定性和定量

黃酮醇的定性依據為本實驗室所建立的葡萄與葡萄酒酚類物質指紋譜庫[18]。定量采用外標法，利用Qualitative Analysis of Masshunter軟件進行峰面積積分作為定量依據，通過不同梯度標準品的峰面積和濃度的線性擬合曲線進行定量，其中黃酮醇定量以槲皮素為外標物，黃烷醇定量以兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表棓兒茶素為外標物。類黃酮類物質含量（mg/kg）以果實鮮質量表示。

1.3.5 數據處理及統計分析

采用SPSS 26.0進行統計分析，采用Excel制表，采用SIMCA 14.1進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 葡萄果實理化指標的測定結果

檢測各品種葡萄果實的基本理化指標，結果見表1。由表1可知，本實驗所用葡萄果實均有較好的成熟度，供試品種果實的pH在3.29～3.87之間，可滴定酸含量在5.19～9.66 g/L之間，可溶性固形物含量在17.2～22.5°Bx之間，其中‘貴人香’（17.18°Bx）和‘雷司令’（18.7°Bx）的可溶性固形物含量顯著低于其他品種（P＜0.05），‘小芒森’可滴定酸（9.66 g/L）含量顯著高于其他品種（P＜0.05），此外‘小芒森’果實的漿果質量顯著小于其他品種（P＜0.05）。

表1 葡萄果實的基本理化指標Table 1 Basic physiochemical indexes of grapes

2.2 黃酮醇含量的測定結果

黃酮醇類化合物具有優秀的生物活性和輔色能力，主要以糖苷化的形式存在于葡萄果皮中，且它的含量和種類與葡萄品種相關[19]。葡萄果皮黃酮醇含量檢測結果見表2。由表2可知，‘小芒森’、‘長相思’和‘雷司令’的黃酮醇含量均在9.50 mg/kg以上，顯著高于其余品種（P＜0.05）。在6個白葡萄品種果皮中共檢測到5種黃酮醇類物質，槲皮素含量最高，約占總黃酮醇總量的80%以上，與MATTIVI F等[20]的研究結果相符，其中‘貴人香’果皮中的槲皮素-3-O-葡萄醛酸苷含量（4.86 mg/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），而槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量（1.60 mg/kg）顯著低于其他品種（P＜0.05）。此外，NOELIA C M等[21]研究調查了白色品種果皮黃酮醇的特征，在所有白色葡萄品種中均檢測到了山奈酚、異鼠李素和槲皮素，而本實驗僅在‘小芒森’和‘長相思’中檢測到異鼠李素，僅在‘貴人香’和‘雷司令’中檢測到蘆丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，可能是由于樣品種植于玻璃溫室，因紫外光濾減而抑制了葡萄果實黃酮醇的合成，這與LENK S等[22]的研究相符。與紅葡萄品種不同，白色葡萄品種的果皮中沒有檢測到西伯利亞落葉松類黃酮醇、丁香亭和楊梅酮，有研究表明[23-24]，合成這些黃酮醇的基因在白葡萄品種中未表達。

表2 葡萄果皮黃酮醇含量的測定結果Table 2 Determination results of content of flavonols in grape peel mg/kg

2.3 黃烷醇含量的測定結果

黃烷醇類化合物主要以原花青素的形式存在于葡萄果皮和種子中。原花青素具有很強的生物活性，具有抗氧化[25]、保護神經系統[26]、抗腫瘤[27]等作用，且安全無毒[28]，具有很高的利用價值。葡萄果皮中黃烷醇含量見表3，葡萄籽中的黃烷醇含量見表4。

表3 葡萄果皮黃烷醇含量的測定結果Table 3 Determination results of contents of flavanols in grape peel mg/kg

由表3可知，‘維歐尼’葡萄果皮具有較高含量的原花青素（2.76 g/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），‘小芒森’次之，‘貴人香’果皮中的黃烷醇含量最少。除原花青素外，供試葡萄果皮中的黃烷醇還包括含量較低的兒茶素、表兒茶素和表棓兒茶素，其中‘霞多麗’果皮中的兒茶素含量（6.93 mg/kg）顯著高于其他品種（P＜0.05），‘貴人香’葡萄果皮中的表棓兒茶素含量（1.32 mg/kg FW）顯著低于其他品種（P＜0.05）。此外，表兒茶素僅在‘霞多麗’和‘雷司令’種子中檢測到。由表4可知，與果皮相比，葡萄籽中的各類黃烷醇化合物含量較高，與VIOLETA I等[29]的研究結果一致。此外，葡萄籽中含有表兒茶素沒食子酸酯，沒食子酰基化可以提高其活性[30]。‘小芒森’葡萄籽中的原花青素含量較高，且四種單體黃烷醇的含量也處在較高的水平，而‘長相思’葡萄籽中的原花青素和單體黃烷醇含量較少。與果皮相比，葡萄籽中黃烷醇的含量較高，僅‘維歐尼’葡萄種子中的黃烷醇含量低于果皮。

表4 葡萄籽中黃烷醇含量的測定結果Table 4 Determination results of contents of flavanols in grape seed mg/kg

平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）能夠說明原花青素在葡萄果皮和種子種的聚合程度。平均聚合度越高，代表分子質量大、空間結構復雜，無法透過生物膜被生物利用[3]。‘貴人香’果皮中原花青素平均聚合度最高（49.66），而‘霞多麗’果皮中原花青素的平均聚合度僅為26.11，平均聚合度最低。在葡萄籽中，‘貴人香’的平均聚合度（44.98）顯著高于其余品種（P＜0.05），最低的是‘雷司令’（10.88）。此外，6個供試品種果皮中的原花青素平均聚合度均高于葡萄籽。

2.4 基于白葡萄果實類黃酮含量的主成分分析

為進一步探究白葡萄品種果實中類黃酮類物質的差異，本研究對類黃酮物質含量進行主成分分析（principal component analysis，PCA），結果見圖1。由圖1a可知，兩個主成分共解釋了61.0%的總方差（主成分1為35.4%，主成分2為25.6%）。從x軸方向看，主成分1能將六個白葡萄品種分成四組，‘貴人香’和‘霞多麗’、‘雷司令’位于正半軸，其中‘霞多麗’和‘雷司令’位于原點附近，‘小芒森’和‘長相思’、‘維歐尼’位于負半軸，其中‘長相思’和‘維歐尼’位于原點附近。結合圖1b可知，‘貴人香’、‘霞多麗’和‘雷司令’均含有較多的表兒茶素，且‘貴人香’含有較多的蘆丁；而異鼠李素、槲皮素-3-葡萄糖苷和果皮表棓兒茶素在‘小芒森’、‘長相思’和‘維歐尼’中含量較高，且‘小芒森’的葡萄籽中黃烷醇含量豐富。主成分2能夠將白葡萄品種分為兩組，其中‘霞多麗’、‘長相思’和‘維歐尼’位于y軸正半軸，‘貴人香’、‘雷司令’和‘小芒森’位于y軸的負半軸。結合載荷圖，位于y軸正半軸的三個品種，其果皮中含有較多的黃烷醇；位于y軸負半軸的三個品種中，‘貴人香’和‘雷司令’果皮中蘆丁和山奈酚含量較高，‘小芒森’種子中的原花青素含量較高。

圖1 基于白葡萄果實類黃酮的主成分分析得分圖（a）和載荷圖（b）Fig.1 Principal component analysis score plot (a) and loading plot(b) based on flavonoids in white grape

3 結論

白葡萄的皮渣在釀酒時不經過浸漬和發酵過程，可以較完整地保留皮渣中的酚類物質。科學利用白色釀酒葡萄皮渣不僅能提高原料利用率，還能減輕環境壓力。本研究以玻璃溫室種植的白色釀酒葡萄品種‘霞多麗’、‘長相思’、‘貴人香’、‘小芒森’、‘雷司令’、‘維歐尼’為材料，利用高效液相色譜-質譜聯用技術檢測其果皮、種子中的類黃酮類物質組成和含量，結果表明，‘長相思’、‘雷司令’和‘小芒森’果皮含有較多的黃酮醇，‘維歐尼’果皮黃烷醇含量較高，‘小芒森’葡萄籽中的黃烷醇含量最高。從黃酮醇種類上看，白色葡萄品種的果皮中沒有檢測到西伯利亞落葉松類黃酮醇、丁香亭和楊梅酮，僅‘小芒森’和‘長相思’含有異鼠李素，‘貴人香’和‘雷司令’含有蘆丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷。此外，僅在‘霞多麗’和‘雷司令’的果皮中檢測到表兒茶素。基于類黃酮物質含量的主成分分析可以將供試的白葡萄品種區分開，說明類黃酮物質的組成和含量與葡萄基因型有關。本研究結果為規模化提取白葡萄皮渣中類黃酮類物質提供了依據。