益生菌發(fā)酵模擬芒果汁特性及產(chǎn)香能力分析

陳瑞鑫，牛詩源，趙雨欣，鐘秋平

（海南大學 食品科學與工程學院，海南 海口 570228）

芒果（Mangifera indicaL.）是一種重要的熱帶水果，由于其香氣獨特、美味和高營養(yǎng)價值被加工成果漿、果汁飲料、發(fā)酵果汁、果酒等[1]。其中，發(fā)酵芒果汁具有巨大的市場潛力和良好的發(fā)展勢頭[2]。香氣是衡量芒果汁產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要指標，但芒果汁加工過程中的熱處理會導致香氣成分的變化，影響果汁的風味[3]。

芒果含豐富的類胡蘿卜素，其在加工過程中的降解可以產(chǎn)生許多具有花香和果香的重要風味物質(zhì)[4]。C9～C15的類胡蘿卜素衍生物不僅具有特殊的香味，而且還具有對人類有益的生物活性功能，如β-紫羅蘭酮、β-環(huán)檸檬醛和β-大馬士酮，它們的大量存在不僅可以賦予果汁特定風味，而且還可以促進機體生物活性的調(diào)節(jié)，具有降血脂、抑制癌細胞的功能[5]。因此，充分利用類胡蘿卜素的降解作用來提高芒果汁的香氣可以進一步提高芒果汁的品質(zhì)[6]。FESSARD A等[7]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵可能是保持甚至改善加工水果產(chǎn)品的營養(yǎng)質(zhì)量和風味的一種有效方法。有研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可通過發(fā)酵積累乳酸來促進類胡蘿卜素的降解，進而減少橙汁樣品中的類胡蘿卜素[8-9]；一些特定種屬的非釀酒酵母菌株，可以合成和分泌胞外糖苷酶，該酶對類胡蘿卜素C13-降異戊二烯化合物的“果香和花香”糖苷有更好的催化選擇性[10]，提高了果汁果酒的香氣復雜性和特色[11]。因此，將乳酸菌和非釀酒酵母應用于芒果汁的發(fā)酵，有望改善發(fā)酵芒果汁的香氣，進而提高其產(chǎn)品質(zhì)量。

本研究采用前期優(yōu)選的2株乳酸菌植物乳桿菌（Lac tobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）和2株非釀酒酵母粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）發(fā)酵模擬芒果汁，測定菌株在模擬芒果汁中的生長、發(fā)酵特性和產(chǎn)香能力，以期為乳酸菌和非釀酒酵母在發(fā)酵芒果汁中的組合應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

美極梅奇酵母（Metschnikowiapulcherrima，MP）GDMCC 140157、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis，RG）GDMCC2.27、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，LP）GDMCC1.140、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei，LC）GDMCC1.159：廣東微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

β-胡蘿卜素（純度98%）、番茄紅素（純度80%）：阿拉丁生化技術有限公司；二氯甲烷、吐溫80、葡萄糖、蔗糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸（均為分析純）：國家標準物質(zhì)中心。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）固（液）體培養(yǎng)基、MRS固（液）體培養(yǎng)基：青島海博生物科技有限公司。

模擬芒果汁[12-15]：葡萄糖12 g/L、果糖39 g/L、蔗糖77 g/L、檸檬酸5.2 g/L、蘋果酸8.8 g/L、β-胡蘿卜素40 mg/L、番茄紅素40 mg/L，pH調(diào)節(jié)至4.5，88 ℃巴氏殺菌15 min。

1.2 儀器與設備

T6紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；Ageilent1100高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫公司；PerkinElmer TGA8000/SQ8T氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀：廣東省中科進出口有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化及種子液制備

非釀酒酵母菌：采用接種環(huán)從YPD斜面培養(yǎng)基上挑取非釀酒酵母菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)24 h制成種子液（106CFU/mL）。

乳酸菌：采用接種環(huán)從MRS斜面培養(yǎng)基上挑取乳酸菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h制成種子液（108CFU/mL）。

1.3.2 模擬芒果汁發(fā)酵

取4株菌株的種子液，以5%（V/V）的接種量接種至模擬芒果汁中，30 ℃、140 r/min條件下發(fā)酵72 h，每隔2 h取樣，繪制菌株的生長曲線，每隔12 h取樣測定pH值、類胡蘿卜素降解率，發(fā)酵72 h后檢測各理化指標及揮發(fā)性風味成分。以自然發(fā)酵的模擬果汁作空白對照（CK），每個樣品重復測定3次。

1.3.3 分析檢測

（1）生長曲線的繪制[16]

采用紫外分光光度計測定樣品在波長600 nm處的吸光度值，每個樣品平行測定3次，以培養(yǎng)時間（x）為橫坐標，OD600nm值（y）為縱坐標，繪制各菌株的生長曲線。

（2）pH值的測定

使用pH計測定。

（3）類胡蘿卜素降解率[17-20]

測定培養(yǎng)液在波長495 nm處的吸光度值，并計算類胡蘿卜素降解率，其計算公式如下：

其中，A1為發(fā)酵0 h時的吸光度值，A2為發(fā)酵后的吸光度值。

（4）糖含量的測定

參照文獻[21]使用HPLC法測定葡萄糖、果糖、蔗糖的含量。

（5）有機酸含量的測定

參照文獻[22]使用HPLC法測定蘋果酸、檸檬酸、乳酸的含量。

（6）揮發(fā)性香氣成分的測定

采用頂空固相微萃取法（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）提取香氣成分，采用GC-MS法進行檢測分析[23-25]，并計算氣味活度值（odor activity value，OAV），其計算公式如下：

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），并對數(shù)據(jù)進行處理和分析，結果用“平均值±標準差”表示，利用Origin 2019b 64Bit軟件繪圖，利用R語言繪制熱圖進行層次聚類分析。

2 結果與分析

2.1 益生菌在模擬芒果汁中的生長曲線

4株菌株在模擬芒果汁中的生長曲線見圖1。由圖1可知，在模擬芒果汁中，植物乳桿菌和干酪乳桿菌分別經(jīng)歷了4 h和8 h的遲滯期后進入快速生長期，24 h之后幾乎同時進入穩(wěn)定期，說明乳酸菌在模擬芒果汁中生長良好；JIN X等[26]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌在芒果汁體系中的遲滯期為4 h，之后進入快速生長期，可能的原因是芒果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)比模擬芒果汁中的營養(yǎng)物質(zhì)更加豐富，導致遲滯期較短。由圖1亦可知，美極梅奇酵母生長速度更快，沒有明顯的生長遲滯期，很快進入生長對數(shù)期，并在發(fā)酵12 h后進入穩(wěn)定期；粘紅酵母經(jīng)歷了約4 h的遲滯期，之后進入快速生長期，14 h后進入穩(wěn)定期。原苗苗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，美極梅奇酵母在YPD液體培養(yǎng)基中經(jīng)歷了約6 h的遲滯期后進入快速生長期；王蓉等[28]研究發(fā)現(xiàn)，粘紅酵母在合成培養(yǎng)基中幾乎沒有遲滯期，這可能與所用的培養(yǎng)基不同所致。

圖1 益生菌在模擬芒果汁中的生長曲線Fig.1 Growth curves of probiotics in simulated mango juice

2.2 益生菌在模擬芒果汁中的發(fā)酵特性

2.2.1 pH值的變化

4株益生菌發(fā)酵模擬芒果汁過程中pH值的變化見圖2。由圖2可知，空白對照組pH變化不明顯（P＞0.05），而非釀酒酵母菌及乳酸菌發(fā)酵模擬芒果汁過程中，pH均呈先下降后趨于平緩的趨勢，且乳酸菌發(fā)酵組下降明顯（P＜0.05）。發(fā)酵72 h時，粘紅酵母、美極梅奇酵母、植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵模擬芒果汁的pH值分別降低至4.74、4.65、3.63、3.74，乳酸菌發(fā)酵模擬芒果汁pH的快速降低與乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生了大量乳酸有關[26]。

圖2 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁過程中pH值的變化Fig.2 Changes in pH value during the fermentation of simulated mango juice by probiotics

2.2.2 糖含量的測定結果

4株益生菌發(fā)酵模擬芒果汁72 h后，果糖、葡萄糖、蔗糖的含量見圖3。由圖3可知，發(fā)酵72 h后，與空白對照組（68.60 g/L、11.00 g/L、33.20 g/L）相比，植物乳桿菌、干酪乳桿菌、粘紅酵母、美極梅奇酵母發(fā)酵組的果糖、葡萄糖及蔗糖含量均下降，分別為48.49 g/L、9.00 g/L、17.97 g/L，54.04 g/L、10.81 g/L、23.50 g/L，4.10 g/L、9.16 g/L、14.47 g/L，16.69 g/L、5.19 g/L、10.34 g/L。其中，粘紅酵母對果糖的利用率最強（94.02%），美極梅奇酵母對葡萄糖和蔗糖的利用率最強（46.27%；68.86%）。對總糖而言，粘紅酵母消耗總糖量最大，總糖含量由112.80 g/L降低至23.73 g/L，總糖利用率為75.42%，其次是美極梅奇酵母，總糖含量降低至32.22 g/L，總糖利用率為71.44%，耗糖最少的為干酪乳桿菌，發(fā)酵后總糖含量為88.35 g/L，總糖利用率為21.68%。可見，不同微生物對糖的消耗能力有差異[29-30]。綜上，美極梅奇酵母利用葡萄糖和蔗糖的能力優(yōu)于粘紅酵母，粘紅酵母對果糖的利用能力更強，兩株乳酸菌在模擬芒果汁體系中的糖利用能力較弱。

圖3 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后糖含量的測定結果Fig.3 Determination results of sugar contents in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

2.2.3 有機酸含量的測定結果

4株益生菌發(fā)酵模擬芒果汁72 h后，有機酸含量見圖4。

圖4 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后有機酸含量的測定結果Fig.4 Determination results of organic acid contents in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

由圖4可知，發(fā)酵72 h后，空白對照組模擬芒果汁中檸檬酸含量為4.89 g/L。與空白對照組相比，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和粘紅酵母發(fā)酵組檸檬酸含量均顯著降低（P＜0.05），分別為3.52 g/L、4.47 g/L和2.88 g/L；美極梅奇酵母發(fā)酵組檸檬酸含量略有增加，為5.49 g/L。發(fā)酵72 h后，空白對照組模擬芒果汁中的蘋果酸含量為8.08 g/L。與空白對照組相比，植物乳桿菌、干酪乳桿菌發(fā)酵組蘋果酸含量均顯著降低（P＜0.05），分別為3.25 g/L、4.18 g/L；粘紅酵母和美極梅奇酵母發(fā)酵組蘋果酸含量略有增加，推測可能是由于益生菌分解糖產(chǎn)生有機酸[31-32]。在空白對照組和兩種非釀酒酵母發(fā)酵的模擬芒果汁中均未檢測到乳酸。植物乳桿菌和干酪乳桿菌在模擬芒果汁中均可產(chǎn)生乳酸，發(fā)酵72 h后，乳酸含量分別為11.27 g/L、8.92 g/L。

2.2.4 類胡蘿卜素降解率的測定結果

模擬芒果汁經(jīng)益生菌發(fā)酵后類胡蘿卜素的降解率見圖5。由圖5可知，發(fā)酵72 h后，空白對照組的類胡蘿卜素降解率為13.77%，美極梅奇酵母和粘紅酵母發(fā)酵組的類胡蘿卜素降解率分別為20.27%和17.73%，植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵組的類胡蘿卜素降解率分別為21.22%和19.80%。可見，乳酸菌發(fā)酵有利于類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化，可能與其發(fā)酵過程中產(chǎn)生較高含量的有機酸有關[15]。綜上，所有菌株均可以降解類胡蘿卜素，其中，植物乳桿菌發(fā)酵的模擬芒果汁對類胡蘿卜素的降解效果最好。

圖5 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后類胡蘿卜素的降解率的測定結果Fig.5 Determination results of degradation rates of carotenoids in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

2.3 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁揮發(fā)性風味成分分析結果

2.3.1 模擬芒果汁發(fā)酵后揮發(fā)性香氣成分分析

采用GC-MS法檢測模擬芒果汁樣品中的揮發(fā)性風味成分，結果見表1。

表1 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后揮發(fā)性風味成分的測定結果Table 1 Determination results of aroma components in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

續(xù)表

由表1可知，從5組模擬芒果汁樣品中共檢測到22種香氣成分，包括醇類、酯類、酸類、萜烯類、酮類、醛類等，其中空白對照組檢測到16種香氣成分，粘紅酵母和植物乳桿菌發(fā)酵組均檢測到19種香氣成分，美極梅奇酵母發(fā)酵組檢測到16種香氣成分，干酪乳桿菌發(fā)酵組檢測到15種香氣成分。

醇類物質(zhì)主要呈清香和青鮮香氣[31]。美極梅奇酵母發(fā)酵組醇類物質(zhì)含量（5 308.78 μg/L）顯著增加（P＜0.05），且苯乙醇含量最高（5 220.82 μg/L），苯乙醇作為主要的芳香醇，具有甜香、玫瑰花香和蜂蜜香，可賦模擬芒果汁以獨特的甜香味[19]。植物乳桿菌發(fā)酵也顯著增加了醇類物質(zhì)（正辛醇、壬醇、香茅醇）的含量（P＜0.05），這與MANDHA J等[33]的研究結果一致。

酮類物質(zhì)香氣持久，貢獻花香和果香[34-35]。除美極梅奇酵母發(fā)酵組外，植物乳酸菌、干酪乳桿菌和粘紅酵母發(fā)酵后的模擬芒果汁酮類物質(zhì)明顯增加，分別為1272.63μg/L、1 163.36 μg/L和1 463.72 μg/L。

酯類物質(zhì)具有甜味和果味[36]。模擬芒果汁中僅檢測到2種酯類物質(zhì)，分別為癸酸乙酯和二氫獼猴桃內(nèi)酯。其中癸酸乙酯具有果香和酒香香氣[37]，二氫獼猴桃內(nèi)酯帶有香豆素樣香氣[38]。4種益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后，酯類物質(zhì)含量明顯高于空白對照組（55.49 μg/L）。

酸對于新鮮果汁風味是必不可少的，但過量的酸可能會在果汁產(chǎn)生負面的香氣[39]。在模擬芒果汁中檢測到3種酸類物質(zhì)，其中苯乙酸最豐富。植物乳桿菌和美極梅奇酵母發(fā)酵后，苯乙酸含量明顯增加（P＜0.05），盡管苯乙酸閾值相對較高（1 000 μg/L），但由于其含量高，對整體風味有很大的影響。

萜烯類物質(zhì)具有玫瑰和柑橘香氣[40]。模擬芒果汁經(jīng)4種益生菌發(fā)酵后，萜烯類物質(zhì)含量顯著增加（P＜0.05），且非釀酒酵母發(fā)酵組高于乳酸菌發(fā)酵組，分析原因可能是萜烯類物質(zhì)在發(fā)酵過程中發(fā)生一些氧化反應，生成醇類、酮類等物質(zhì)[33]。

醛類物質(zhì)與果實成熟的特征香氣密切相關[31]。除美極梅奇酵母發(fā)酵組外，植物乳酸菌、干酪乳桿菌和粘紅酵母發(fā)酵后的模擬芒果汁醛類物質(zhì)顯著增加（P＜0.05），其中，β-環(huán)檸檬醛化合物含量較高，因其化合物閾值小，對整體風味有很大的影響。

有研究表明，OAV在0.1～1.0之間的香氣成分不會直接參與香氣的呈現(xiàn)，而可能通過與其他成分的相互作用來促進香氣的呈現(xiàn)[41]。因此，選取OAV＞0.1時的香氣成分進行進一步研究。

2.3.2 基于揮發(fā)性風味成分不同模擬芒果汁樣品聚類分析

為了更直觀地分析不同益生菌發(fā)酵的模擬芒果汁中香氣物質(zhì)的差異，基于揮發(fā)性風味成分進行聚類分析。結果見圖6。

由圖6可知，不同樣品間存在較大差異。空白對照組模擬芒果汁中的香氣物質(zhì)較少。模擬芒果汁經(jīng)不同益生菌發(fā)酵后，香氣成分發(fā)生不同變化。植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生更多的β-環(huán)檸檬醛、正辛醇、壬醇、二氫獼猴桃內(nèi)酯和2,6,6-三甲基環(huán)己酮。粘紅酵母發(fā)酵產(chǎn)生更多的β-紫羅蘭酮、庚醛、異佛爾酮、二氫-α-紫羅蘭酮、苯乙醛、芳樟醇、3-蒈烯。美極梅奇酵母發(fā)酵后，產(chǎn)生的降異戊二烯化合物較少，苯乙醇、癸酸乙酯、苯乙酸和α-萜品烯含量較高。干酪乳桿菌發(fā)酵后則產(chǎn)生更多具有青草香味的正庚醇。

圖6 基于揮發(fā)性風味成分益生菌發(fā)酵模擬芒果汁樣品聚類分析結果Fig.6 Results of cluster analysis of the volatile components in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

2.3.3 模擬芒果汁發(fā)酵后降異戊二烯類化合物香氣成分分析

降異戊二烯類化合物由于感官閾值較低而對果酒果汁香氣品質(zhì)具有重要影響[24]，其是類胡蘿卜素分解的產(chǎn)物，在果汁發(fā)酵產(chǎn)物的香氣中起著關鍵作用。CAI C等[41]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在內(nèi)源添加類胡蘿卜素基礎培養(yǎng)基中發(fā)酵，提高了降異戊二烯化合物的指數(shù)。同樣，前期研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵內(nèi)源添加β-胡蘿卜素和番茄紅素的模擬芒果汁中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并檢測到二氫獼猴桃內(nèi)酯、異佛爾酮、β-紫羅蘭酮、二氫-α-紫羅蘭酮、2,2,6-三甲基環(huán)己酮、β-環(huán)檸檬醛6種降異戊二烯化合物[23]。4株益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后降異戊二烯類化合物的含量見圖7。

圖7 益生菌發(fā)酵模擬芒果汁后降異戊二烯類化合物含量的分析結果Fig.7 Analysis results of norisoprenoids compounds contents in simulated mango juice after the fermentation by probiotics

由圖7可知，除美極梅奇酵母發(fā)酵組（955.82 μg/L）外，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和粘紅酵母發(fā)酵組中降異戊二烯化合物含量均顯著高于空白對照組（1 868.56 μg/L）（P＜0.05），分別為2415.72μg/L、2232.63μg/L、2567.51μg/L。結果表明，植物乳桿菌、干酪乳桿菌和粘紅酵母3株菌株在模擬芒果汁發(fā)酵中可以提高降異戊二烯化合物含量，從而提發(fā)酵模擬芒果汁的特征香氣質(zhì)量。降異戊二烯化合物中，β-紫羅蘭酮、異佛爾酮和2,2,6-三甲基環(huán)己酮是β-胡蘿卜素中的C9～C10雙鍵裂解引起的典型降解產(chǎn)物[41，43]；β-環(huán)檸檬醛是由β-胡蘿卜素C7～C8鍵斷裂產(chǎn)生的[42]；二氫獼猴桃內(nèi)脂可能是由類胡蘿卜素的初級氧化產(chǎn)物形成的[43]；二氫-α-紫羅蘭酮為胡蘿卜素、油桃和煙草的風味前體，其是由α-紫羅蘭酮通過催化加氫反應合成的[44]。

3 結論

該研究選用粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）、美極梅奇酵母（Metschnikowia pulcherrima）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）和干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發(fā)酵模擬芒果汁發(fā)現(xiàn)，4株益生菌在模擬芒果汁中均能良好生長，乳酸菌的產(chǎn)酸能力較好，且植物乳桿菌產(chǎn)酸能力最強，發(fā)酵模擬芒果汁72 h后，pH和有機酸含量分別為3.63、18.04g/L；非釀酒酵母的糖利用能力較好，且粘紅酵母的糖利用能力最好，發(fā)酵模擬芒果汁72 h后，總糖含量為23.73 g/L；4株益生菌均能降解類胡蘿卜素，其中植物乳桿菌的降解率最高，為21.22%；植物乳桿菌和粘紅酵母的產(chǎn)香能力較好，從發(fā)酵模擬芒果汁中均鑒定出揮發(fā)性香氣成分19種，且降異戊二烯香氣含量較高，分別為2 415.72 μg/L、2 567.51 μg/L。說明4株益生菌均可以用于芒果汁發(fā)酵，以提高芒果汁中降異戊二烯類化合物的含量，進而提升芒果汁品質(zhì)和香氣復雜性。