產γ-氨基丁酸乳酸菌的分離鑒定及其發酵條件優化

馬 莉，劉慧燕，方海田*，辛世華，李一鳴，賀捷群

（1.寧夏大學 食品與葡萄酒學院 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏工商職業技術學院 旅游管理系，寧夏 銀川 750021）

漿水主要是將蓮花菜、芹菜等蔬菜切條后放入發酵器皿，而后加入煮沸的面湯，待冷卻后以舊漿水做引子進行發酵而成。主要分布在我國陜西、甘肅、寧夏等西北地區[1-2]，其氣味清香、口感酸爽，可止渴消食、利小便、止嘔吐、治瀉痢等[3]。近年，研究者發現，漿水的風味和發酵品質與參與發酵的微生物的特性有關[4]。同時，漿水中含有許多功能性乳酸菌株，漿水的許多功能性被認為與乳酸菌及其代謝產物息息相關。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA），是由α-谷氨酸（α-aminoglutaric acid，GA）通過谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）催化脫羧生成的非蛋白氨基酸[5]。GABA具有改善睡眠[6]、降血壓[7]、防止動脈硬化[8]和改善肝、腎臟功能[9]等多種生理功效。生產GABA的方法有三種[10]，分別為微生物發酵法、化學合成法和植物富集法。微生物發酵法相比于化學合成法和植物富集法，具有操作簡單、專一性高且環保等優點[11]。微生物發酵法是將L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）通過谷氨酸脫羧酶將其轉化為GABA。目前，乳酸菌因為其本身較安全且性能優良，已成為微生物法生產GABA的優勢菌種[12]。

產GABA的乳酸菌株由于其分離源不同，GABA產量及發酵特性存在很大的差異。肖秋穎等[13]從川西高原傳統發酵牦牛乳中分離出發酵乳桿菌84，GABA產量為1.587 g/L；國立東等[14]從東北酸菜中篩選出植物乳桿菌HUCM115，GABA產量為101.3 μg/mL；劉璐等[15]從發酵魚醬酸中分離出植物乳桿菌Y279，GABA產量為0.209 g/L。PARK S Y等[16]從泡菜中分離出的植物乳桿菌K154，GABA產量為0.170 g/L；SANTOS-ESPINOSA A等[17]從墨西哥干酪中分離出的乳酸乳球菌L-571，GABA產量為（1 153.1±13.5）mg/L。

本研究以寧夏地區傳統發酵食品漿水為原料，采用純培養、薄層層析法及高效液相色譜法分離篩選出具有GABA生產能力的菌株，并對其進行形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定，通過耐酸耐膽鹽性試驗及生長特性分析，篩選出最優菌株，并采用單因素試驗及響應面試驗對菌株產GABA發酵條件進行優化，以期為生產食品級GABA及下一步應用到果蔬汁的發酵提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

漿水（主要成分蓮花菜、芹菜、面湯）：采自寧夏當地農戶。

1.1.2 化學試劑

細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；乙腈（色譜純）：天津市大茂化學試劑廠；γ-氨基丁酸標準品（純度＞98%）：上海愛解生物科技有限公司；丹磺酰氯（分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；酵母粉（生化試劑）、乙酸鈉（分析純）：銀川偉博鑫生物科技有限公司；瓊脂粉（分析純）、L-谷氨酸（L-Glu）（純度＞98%）：上海優寧維生物科技有限公司。

1.1.3 培養基

MRS固體培養基、MRS肉湯培養基：青島高科技工業園海博生物技術有限公司。

含L-Glu的發酵培養基：MRS肉湯培養基中加入2%瓊脂粉、1.5%L-谷氨酸。121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養箱：廣東省醫療器械廠；WFZ UV-2000型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；安捷倫1260高效液相色譜儀：安捷倫（中國）科技有限公司；BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；TGL-16M高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；C200凝膠電泳成像分析系統：美國Azure Biosystems生物公司；PHSJ-3F pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；Mastercycler X50聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Eppendorf公司；164-5050電泳儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

將漿水汁稀釋至10-3、10-4，均勻涂布于MRS固體培養基，37 ℃靜置培養48 h，挑選形態外觀良好、具有典型乳酸菌菌落特征的單菌落再次分離純化，最后采用脫脂乳保藏法保藏用于后續實驗。

1.3.2 產GABA乳酸菌的定性和定量分析

（1）薄層層析法定性測定GABA

將預先保藏好的菌株接種到MRS液體培養基連續活化兩代，以4%的接種量接種到含L-Glu的發酵培養基，37 ℃培養48 h，從離心后的培養液取上清液，利用薄層層析法[18]定性測定GABA，展開劑為正丁醇、冰醋酸、水（4∶3∶1，V/V），以0.6%的茚三酮溶液作為顯色劑，以0.1%的GABA標準品作為對照，進行薄層層析，層析完畢干燥后噴顯色劑進行顯色，比較比移值（Rf值）。若樣品與GABA標準品出現相同的Rf值，說明樣品中有GABA產生。

（2）高效液相色譜法定量測定GABA

將利用薄層層析法定性后具有產GABA能力的菌株采用高效液相色譜法[19-20]測定GABA產量。衍生化反應：取發酵液樣品/GABA標品200μL，加入200μLNaHCO3-Na2CO3緩沖液（pH=11.2）和400 μL 9 g/L的丹磺酰氯溶液，充分振蕩5 s，30 ℃反應30 min，過0.45 μm濾膜。

高效液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.025mol/L乙酸鈉，用4%的乙酸調pH至6.2±0.05，流動相B為乙腈，流速為1.0 mL/min；梯度洗脫表見表1，柱溫40 ℃，進樣量20 μL，檢測波長386 nm。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

1.3.3 產GABA菌株的鑒定

（1）形態學特征和生理生化鑒定

形態學觀察：根據《伯杰細菌鑒定手冊》[21]中對乳酸菌進行菌落及細胞形態觀察。

生理生化試驗：參考《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[22]和《伯杰細菌鑒定手冊》，對初篩的優良菌株進行明膠液化、過氧化氫酶、硝酸還原、淀粉水解、硫化氫（H2S）、糖發酵等生理生化特性試驗。

（2）16S rDNA分子生物學鑒定

DNA的提取使用細菌基因組DNA 提取試劑盒，通用引物為：27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），1492R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR擴增體系（25 μL）[23]：PremixTaq酶12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水（ddH2O）9.5 μL。PCR擴增條件[24]：94 ℃預變性15 min；94 ℃變性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環；72 ℃再延伸10 min。PCR 擴增產物進行電泳后，用凝膠成像儀進行觀察，將有效PCR擴增產物在低溫下送至生工（上海）股份有限公司進行測序。測序后的16S rDNA基因序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的Gen-Bank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源搜索比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹。

1.3.4 篩選菌株耐受性及生長特性

（1）耐酸性試驗

益生菌在進入人體腸道的過程中需要耐受胃部的酸性環境[25]，只有當活菌進入胃腸道后，益生功能才能發揮出來。所以，耐酸性是衡量乳酸菌優良特性的重要指標。將MRS液體培養基初始pH值調至2.5，在此條件下將試驗菌在37 ℃下進行恒溫培養，分別將0 h和3 h的培養液進行活菌平板計數。

（2）耐膽鹽試驗

以MRS為基礎培養基，添加0.3%的豬膽鹽[26]，將試驗菌37 ℃恒溫培養，分別將0 h和3 h的培養液進行活菌平板計數。

（3）生長曲線及產酸曲線

將連續活化兩代后的菌株在37 ℃培養，每隔4 h取樣，測定其OD600nm值及pH值的變化，繪制菌株生長曲線及產酸曲線。

1.3.5 存活率計算公式

式中：N1表示培養3 h 測定的活菌數對數，lg（CFU/mL）；N0表示培養0 h 測定的活菌數對數，lg（CFU/mL）。

1.3.6 發酵條件的優化

（1）單因素試驗

以發酵液初始pH值為5.0、發酵溫度為37 ℃、培養時間為48 h為初始試驗條件，在此基礎上分別考察初始pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5）、發酵溫度（31 ℃、33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃）、發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）對GABA產量的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，以初始pH值（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為自變量，以GABA產量（Y）為響應值，采用響應面試驗優化發酵條件，響應面試驗因素與水平見表2。

表2 發酵條件優化響應面試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation conditions optimization

2 結果與分析

2.1 產GABA菌株的定性、定量測定結果

本實驗共分離出21株乳酸菌株（分別編號1～11，①～⑩），采用薄層層析法定性檢測結果見圖1。

圖1 篩選菌株發酵液薄層層析色譜圖Fig.1 Thin layer chromatography of fermentation broth of screened strain

由圖1可知，21株乳酸菌中有6株菌（編號為2、6、7、③、⑦、⑧）與GABA標準品有相同的Rf值，其中菌株2顏色最深，說明其GABA產量最高。采用高效液相色譜法對6株分離菌發酵液中GABA含量進行測定，結果見圖2。

圖2 篩選菌株發酵液中γ-氨基丁酸含量HPLC測定結果Fig.2 Determination results of γ-aminobutyric acid contents in fermentation broth of screened strain by HPLC

由圖2可知，6株分離菌株產GABA的能力存在一定差異，其中分離菌株2、⑧發酵液中GABA產量相對較高，而其他分離菌發酵液中產量較低。根據其他學者的研究，劉曉飛等[27]從寒土地中篩選出的5株乳酸菌，GABA產量最低為0.56 g/L，最高為0.81g/L；田蕊等[28]從酸馬奶中分離出的17株乳酸菌的GABA產量為0.015～0.731 g/L；王興潔等[29]從四川泡菜中篩選出的4株乳酸菌的GABA產量為1.54～2.18 g/L。分析發現，從同一種分離源中篩選出來的乳酸菌GABA產量有所不同，與本研究的結果一致。結果表明，菌株2產GABA能力最強，其GABA產量為0.22 g/L。

2.2 產GABA菌株的生理生化及其分子生物學鑒定結果

2.2.1 篩選菌株形態學觀察

6株篩選菌株形態學觀察結果見圖3。由圖3a可知，6株分離菌菌落呈現白色圓形狀，表面干凈，中間凸起，具有微微的酸味；由圖3b可知，經革蘭氏染色后顯現紫色，說明為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下觀察呈桿狀。

圖3 6株篩選菌株的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.3 Colony (a) and cell (b) morphology of 6 screened strains

2.2.2 篩選菌株生理生化試驗

6株篩選菌株生理生化試驗結果見表3。由表3可知，糖發酵實驗中菌株2、6、7、③、⑦、⑧不能利用鼠李糖、乳糖，結果呈陰性，其他實驗結果均呈陽性。6株分離菌的明膠液化、淀粉水解、過氧化氫酶等實驗結果均呈陰性，根據《伯杰細菌鑒定手冊》[21]可初步判定這6株菌為乳桿菌屬。

表3 6株篩選菌株生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochemical tests of 6 screened strains

2.2.3 分子生物學鑒定結果

6 株篩選菌株16S rDNA基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖4。由圖4可知，在1 500 bp左右有明顯的條帶出現。測序后，將測序結果提交至GenBank數據庫進行BLAST比對，選取同源性較高的模式菌株的16SrDNA序列，用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，結果見圖5。由圖5可知，菌株2、6、7、③、⑦與植物乳桿菌同源性最高，均被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），菌株⑧與發酵乳桿菌同源性最高，被鑒定為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）。

圖4 6株篩選菌株16S rDNA序列的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of 16S rDNA of 6 screened strains

圖5 基于16S rDNA基因序列6株篩選菌株的系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 6 screened strains based on 16S rDNA gene sequence

2.3 菌株的耐受性實驗結果

耐受能力是益生菌的重要特性之一。將篩選的6株菌株進行耐受性實驗，結果見圖6。由圖6a可知，當膽鹽含量為0.3%，培養3 h后6株菌的存活率均＞88%，且活菌數符合乳酸菌發揮作用的最低值，說明這6株菌膽鹽耐受性良好，其中菌株2膽鹽耐受性最好。在相同膽鹽含量下，王祎然等[30]從酸湯中篩選出的6株乳酸菌培養3 h后存活率均＞88%；胡斌等[31]對8株菌培養2 h后存活率為24.1%～91.1%；李洋等[32]對6株菌培養3 h后存活率為5.37%～41.64%。可以看出，本實驗6株菌對膽鹽的耐受能力更好。由圖6b可知，在pH為2.5的酸性條件下培養3 h后，6株菌存活率均＞86%，活菌數達到了107CFU/mL，說明這6株菌均具有良好的耐酸性，其中菌株2耐酸性最好。云月英等[33]對4株乳酸菌在pH值為3時培養3 h，存活率為5.4%～80%；王帥靜等[34]對7株菌在pH為2和3時培養時幾乎不生長。可見本實驗6株菌對酸的耐受能力更強。

圖6 6株篩選菌株的膽鹽（a）及酸（b）耐受性Fig.6 Tolerance of bile salt (a) and acid (b) of 6 screened stains

2.4 菌株2的生長及產酸曲線

將產GABA能力最強的菌株2進行生長及產酸曲線測定，結果見圖7。由圖7可知，菌株2在4 h后生長速率加快，呈指數增長，在16 h后趨于穩定。同時，能否快速產酸也標志著乳酸菌活力是否良好。由圖7可知，菌株2在16 h內快速產酸，因此說明該菌具有良好的生長和產酸能力。

圖7 菌株2的生長曲線及產酸曲線Fig.7 Growth and acid production curves of strain 2

2.5 發酵條件優化單因素試驗結果

將產GABA能力最強的菌株2發酵條件進行單因素試驗優化，結果見圖8。適宜的pH值對菌株的生長有很大的促進作用，pH值也是控制酶活的重要因素，有相關研究表明[35]，谷氨酸脫羧酶（GAD）的活性在pH值為4～6時表現最佳，pH值升高會導致脫羧作用減弱，從而使GABA分解加快。

圖8 初始pH值（a）、發酵溫度（b）和發酵時間（c）對γ-氨基丁酸產量的影響Fig.8 Effect of initial pH (a),fermentation temperature (b) and time (c) on γ-aminobutyric acid yield

由圖8a可知，當初始pH值為4.5～5.5時，發酵液中GABA產量隨初始pH值增加而升高；當初始pH值為5.5時，發酵液中GABA產量最高，為0.55 g/L；當初始pH值＞5.5之后，發酵液中GABA產量有所下降。因此，選擇最適發酵初始pH值為5.5。適宜的溫度是微生物生長和代謝的前提。由圖8b可知，當發酵溫度為31～35 ℃時，發酵液中GABA產量隨溫度增加而升高；當發酵溫度為35 ℃時，發酵液中GABA含量達到峰值為0.59 g/L；當發酵溫度＞35 ℃之后，發酵液中GABA產量有所下降。因此，選擇最適發酵溫度為35 ℃。由圖8c可知，當發酵時間為24～60 h時，發酵液中GABA隨發酵時間增加而升高；當發酵時間到達60 h時，發酵液中GABA產量達到最高，為0.62 g/L；當發酵時間＞60 h之后，隨著時間的增加GABA產量無明顯變化，可能是因為發酵液中底物已經完全分解。因此，選擇最適發酵時間為60 h。

2.6 發酵條件優化響應面試驗分析

在單因素試驗基礎上，以初始pH值（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為自變量，以GABA產量（Y）為響應值，采用響應面試驗優化發酵條件，響應面試驗設計及結果見表4。

表4 發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 4 Design and results of response surface experiments for fermentation conditions optimization

以GABA產量為（Y）為響應值，以發酵液初始pH值（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）為自變量建立回歸方程如下：

由表5可知，該模型P值＜0.000 1，表明該回歸模型中每項對結果的影響極顯著，失擬項P值=0.296 0＞0.05，表明該回歸模型擬合度良好，具有一定的可信度。回歸方程的決定系數R2為0.986 5，校正決定系數R2adj為0.969 2。由P值可知，該模型一次項B、交互項BC和二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），其他項的對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個因素對GABA產量的影響強弱順序為：發酵溫度＞發酵時間＞初始pH值。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

各因素間交互作用對GABA產量影響的響應面及等高線見圖9。由圖9可知，GABA產量隨著各因素數值的不斷增加呈先增高后降低的趨勢，說明各因素之間具有一定的交互作用。其中BC曲面彎曲程度最大，等高線呈現橢圓狀，說明BC交互作用及極顯著（P＜0.01），而AB和AC等高線更偏向圓形，說明其交互作用不顯著，表明交互作用對GABA產量影響相對較小。該結果與方差分析結果一致。

圖9 初始pH值、發酵溫度和發酵時間間交互作用對γ-氨基丁酸產量影響的響應面和等高線Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and time on γ-aminobutyric acid yield

通過響應面軟件對方程求解，得到最佳發酵條件為：發酵液初始pH值5.78、發酵溫度36 ℃、發酵時間63.03 h，在此條件下，GABA產量理論值為0.788 7 g/L。為了驗證模型的可靠性，同時考慮到操作及成本問題，將上述發酵條件修正為：發酵液初始pH值5.8、發酵溫度36 ℃，發酵時間60 h。在此優化條件下，GABA 產量實際值為0.778 g/L，與理論值相接近，表明該方案可行。

3 結論

本研究從寧夏當地漿水中分離出21株菌株，利用薄層層析法、高效液相色譜法篩選出6株具有產GABA能力的菌株，經形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學鑒定，確定5株為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），1株為發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）。將GABA產量最高的植物乳桿菌2為試驗菌株，其優化發酵條件為初始pH值5.8，發酵溫度36 ℃，發酵時間60 h。在此優化條件下，GABA的產量為0.778 g/L，比優化之前產量提高了3.5倍，為生產食品級GABA及下一步應用到果蔬汁的發酵提供研究基礎。